类黄酮、运动、肠道来源的酚类物质

研究设计：研究参与者 (N=85) 将被纳入研究并随机分配到类黄酮或安慰剂补充剂组，为期 2 周，这两个独立组平行进行（预计 N=80 将成功完成所有研究阶段） . 补充剂将以胶囊形式以双盲方式给药。 研究参与者将向研究机构报告进行基线测试和定向，然后进行预研究和 2 周补充后，然后在 24 小时后再次进行。 如图所示（补充前和补充后、运动/休息后和运动/休息后 24 小时），将收集四个血样。 在补充 2 周后向实验室报告时，研究参与者将被随机分配到在跑步机上坐下或快走 45 分钟。 将包括一个由 20 名摄入类黄酮补充剂并在实验室中跑步 2.5 小时的跑步者组成的比较组，以比较中度和剧烈运动（并为未来的研究提供试点数据）。 基线测试：研究开始前一到两周，将向研究参与者（步行者和跑步者）提供研究方向，然后提供自愿同意。 将给出有关在 3 天食物日志（开始补充之前的星期四、星期五和星期六）中记录所有食物和饮料摄入量的说明。 人口统计和培训历史将通过问卷调查获得。 将测量身高、体重和体脂百分比（seca Medical Body Composition Analyzer 514 bioelectrical impedance scale, Hanover, MD）。 VO2max 将使用 Bruce 的跑步机方案进行评估，并使用 Cosmed CPET 代谢系统持续监测耗氧量和通气量。

补充前实验室访问：在研究的第一天，参与者（步行者和跑步者）将在禁食状态下返回实验室（9 小时或更长时间，除水外没有任何食物或饮料）。 血样将从肘前静脉采集，受试者处于坐姿。 参与者（步行者）将获得为期 2 周的类黄酮或安慰剂胶囊供应，这些胶囊被组织在补充托盘中以促进依从性。 跑步者将获得为期 2 周的类黄酮胶囊。 研究团队将审查和收集 3 天的食物记录，并使用 Food Processor v. 11.1 (ESHA Research, Salem, OR) 分析营养素和类黄酮含量。 将评估每种食品/饮料的常量和微量营养素、总黄酮和六种类黄酮亚类中每一种的小计，以及两种单独的类黄酮值（槲皮素、EGCG）。 在 #3 访问实验室之前的 2 天期间，以及包括访问 #3 在内的一整天，参与者将被要求避免食用含有三氯蔗糖 (Splenda) 和甘露糖醇的食物和饮料。 为避免三氯蔗糖和甘露醇，参与者将被要求查看无糖苏打水、酸奶和其他乳制品、休闲食品、口香糖和糖果、低糖产品、牙膏和漱口水的配料表。

补充后实验室访问：

在 2 周的补充期后，参与者（步行者和跑步者）将在禁食过夜的状态下返回实验室（与补充前实验室访问的同一天）。

参与者将上交补充剂托盘以验证是否遵守服用胶囊的规定。 将采集血样。 参与者（步行者）将被随机分配到在实验室中静坐 45 分钟或在最大摄氧量为 60% 的 5% 分级跑步机上快走 45 分钟（前 5 分钟进行代谢监测，然后在 15、30、和 45 分钟）使用 Cosmed CPET 代谢推车。 跑步者将在未分级跑步机上以 70% VO2max 跑步 2.5 小时，每 30 分钟进行一次代谢测量。 水将随意提供给所有参与者，不允许其他饮料或食物。 在坐着或步行实验室课程之前，以及 2.5 小时的跑步，参与者将消耗 150 毫升溶液，其中包含 1 克蔗糖、1 克乳果糖、0.5 克 L-鼠李糖、1 克赤藓糖醇、1 克三氯蔗糖、0.5 克甘露醇.

将尿液收集在塑料容器中 24 小时，分为两个单独的部分：0-5 小时和 5-24 小时。 在前 5 小时的尿液收集期间，不允许进食或饮水（自来水除外）。 参与者将在隔夜禁食状态下于第二天早上返回，提供血样并上交尿液样本。

受试者尿液收集指南：

• 您应该在每个收集期间收集每一滴尿液（从运动开始后 5 小时，然后第二次收集持续到第二天早上或运动开始后 5 到 24 小时）。 每次排多少尿都没有关系，只要收集每一滴尿液即可。
• 在两个收集瓶中收集白天和晚上的每一滴尿液（0-5 小时、5-24 小时，从实验室运动测试开始时开始）。 将瓶子存放在冰箱中。 一定要收集排便时排出的所有尿液。
• 最后收集第二天早上排出的第一批尿液，将其添加到收集瓶中。 将两个尿液收集瓶带到实验室（即，在运动后的早晨，您将提供最终的血液样本）。

类黄酮补充剂：补充剂和安慰剂胶囊将由 Reoxcyn Innovation Group LLC（犹他州盐湖城）制备。 （参见附件中的补充信息）。 成分将与社区试验中测试的相同：维生素 C（作为抗坏血酸棕榈酸酯）（Green Wave Ingredients，La Mirada，CA），野生越橘果实提取物（25% 总花青素）（FutureCeuticals，Momence，IL），绿茶叶提取物 (50% EGCG)（Watson Industries, Inc., Pomona, CA）、槲皮素苷元（Novel Ingredients, East Hanover, NJ）、咖啡因（Creative Compounds, Scott City, MO）和 omega 3 脂肪酸（Novotech Nutraceuticals ，加利福尼亚州文图拉）。 胶囊填充成分和赋形剂包括 Nu-Flow 70R（来自稻壳）、来自木薯根的木薯粉、天然竹硅石、棉花糖根。 安慰剂胶囊将仅包含填充成分和赋形剂（不含活性成分）。 步行者每天服用 2 粒类黄酮或 2 粒安慰剂胶囊。 两个类黄酮胶囊提供 329 毫克类黄酮（根据研究，美国成年人的平均摄入量为每天 240 毫克）。 跑步者每天服用 4 粒类黄酮胶囊（658 毫克类黄酮）。 参与者将获得为期 2 周的类黄酮或安慰剂胶囊，并说明如何每天分次服用（早餐服用 1 剂，午餐服用 1 剂，或者跑步者的剂量加倍）。 如果错过一两天服用补充剂，研究参与者将被允许每天额外添加一粒胶囊以增加摄入量。 在步行/休息（或跑步）实验室会议期间提供血液样本后，研究参与者将摄入 2 粒胶囊（跑步者 4 粒）。

Mary Ann Lila 博士（NCSU，人类健康植物研究所，NCRC）将在研究前和研究后测试补充胶囊的类黄酮含量。

靶向代谢组学分析：

肠道来源的酚类代谢物将通过 SPE 使用自动化平台和内部 96 孔 SPE 方案（60mg，3mL；Phenomenex）从血浆中纯化，用于提取 100 μL 组织。 所有分析物之前都经过优化，提取效率在 80-100% 之间，CV ≤ 10%。 提取物将通过液相色谱串联-MS/MS 进行分离和量化，涉及先前发布和验证的方法。 简而言之，HPLC-ESI-MS/MS 分析将使用配备电喷雾电离 (ESI) Turbo-V 源（血液和粪便代谢物）的 SCIEX UPLC 耦合 6500 + MS/MS-QTRAP™ 进行，样品注入到Kinetex PFP 色谱柱和流动相梯度由 0.1% 甲酸 (v/v) 水溶液 (A) 和 0.1% 甲酸 (v/v) 乙腈溶液 (B) 组成，分离时间为 24 分钟。 目标代谢物分析方案已经过优化和验证，可检测超过 200 种分析物，这些分析物是相对于我们库中真实的商业和合成标准进行量化的，使用涉及 3-5 个独特转换的碎片分析确定了推定的 II 期偶联物。 这涉及扫描 1000 多个对应于硫酸盐、葡糖苷酸、甲基和甘氨酸结合物的跃迁。 这种 SMRM 方法先前针对 Rexocyn 处理进行了优化，提供了一种比传统多反应监测 (MRM) 扫描程序更灵敏的方法，因为它除了允许独特的化合物依赖性外，还允许监测每单位时间更多的转换用于每种分析物的参数，从而提高灵敏度。 最后，将根据保留时间（尽可能使用可靠的和合成的标准品）和三个或更多前体到产物的离子跃迁来确认代谢物。 范围从 0 到 10 μM 的七点基质匹配校准曲线将用于类黄酮的分析，或者范围从 0 到 50 μM 的范围用于酚类代谢物的分析。

肠道通透性，尿乳果糖/鼠李糖：

尿糖浓度将通过高压液相色谱法测定。 0-5 小时尿液中的蔗糖、0-5 小时尿液中的乳果糖/鼠李糖 (L/R) 比率和 5-24 小时尿液中的三氯蔗糖/赤藓糖醇 (S/E) 比率将用作胃十二指肠的指标，小肠和大肠的渗透性，分别。