Flavonóides, exercício, fenólicos derivados do intestino

Projeto de pesquisa: os participantes do estudo (N = 85) serão inseridos no estudo e randomizados para os grupos de suplementos de flavonoides ou placebo por 2 semanas, com esses dois grupos independentes executados em paralelo (com N = 80 previsto para concluir com sucesso todas as fases do estudo) . Os suplementos serão administrados de forma duplo-cega na forma de cápsulas. Os participantes do estudo se reportarão ao centro de pesquisa para testes e orientação de linha de base, e então pré-estudo e após 2 semanas de suplementação, e novamente 24 horas depois. Quatro amostras de sangue serão coletadas conforme mostrado na Figura (pré e pós-suplementação, pós-exercício/repouso e 24 horas pós-exercício/repouso). Ao comparecer ao laboratório após 2 semanas de suplementação, os participantes do estudo serão randomizados para sentar ou caminhar rapidamente em esteiras por 45 minutos. Um grupo comparador de 20 corredores ingerindo o suplemento de flavonoides e correndo 2,5 h no laboratório será incluído para permitir uma comparação entre esforço moderado e intenso (e para fornecer dados piloto para um estudo futuro). Teste de linha de base: Uma a duas semanas antes do início do estudo, os participantes do estudo (caminhantes e corredores) receberão uma orientação para o estudo e, em seguida, fornecerão consentimento voluntário. Serão dadas instruções para registrar toda a ingestão de alimentos e bebidas em registros alimentares de 3 dias (quinta, sexta e sábado antes de iniciar a suplementação). Os históricos demográficos e de treinamento serão adquiridos com questionários. Altura, peso corporal e percentual de gordura corporal (balança de impedância bioelétrica seca Medical Body Composition Analyzer 514, Hanover, MD) serão medidos. O VO2max será avaliado usando o protocolo de esteira de Bruce, com consumo de oxigênio e ventilação monitorados continuamente usando o sistema metabólico Cosmed TCPE.

Visita ao laboratório pré-suplementação: No primeiro dia do estudo, os participantes (caminhantes e corredores) retornarão ao laboratório em jejum (9 ou mais horas sem comida ou bebida além de água). Amostras de sangue serão coletadas de uma veia antecubital com os indivíduos na posição sentada. Os participantes (caminhantes) receberão um suprimento de 2 semanas de flavonóides ou cápsulas de placebo organizadas em bandejas de suplementos para facilitar a adesão. Os corredores receberão um suprimento de 2 semanas de cápsulas de flavonóides. O registro alimentar de 3 dias será revisado e coletado pela equipe de pesquisa e analisado quanto ao conteúdo de nutrientes e flavonoides usando o processador de alimentos v. 11.1 (ESHA Research, Salem, OR). Cada alimento/bebida será avaliado para macro e micronutrientes, flavonóides totais e subtotais para cada uma das seis subclasses de flavonóides e dois valores individuais de flavonóides (quercetina, EGCG). Durante o período de 2 dias antes da visita nº 3 ao laboratório e durante todo o dia que inclui a visita nº 3, os participantes serão solicitados a evitar alimentos e bebidas que contenham sucralose (Splenda) e manitol. Para evitar a sucralose e o manitol, os participantes serão solicitados a verificar as listas de ingredientes de refrigerantes dietéticos, iogurte e outros produtos lácteos, salgadinhos, gomas de mascar e balas, produtos com baixo teor de açúcar, pasta de dente e enxaguatório bucal.

Visitas de laboratório pós-suplementação:

Após o período de suplementação de 2 semanas, os participantes (caminhantes e corredores) retornarão ao laboratório em jejum noturno (no mesmo dia da semana da visita ao laboratório pré-suplementação).

Os participantes irão entregar a bandeja do suplemento para verificar o cumprimento da ingestão das cápsulas. Uma amostra de sangue será coletada. Os participantes (caminhantes) serão randomizados para sentar por 45 minutos no laboratório ou caminhar rapidamente por 45 minutos em uma esteira graduada de 5% a 60% VO2max (com monitoramento metabólico durante os primeiros 5 minutos e depois aos 15, 30, e 45 minutos) usando o carrinho metabólico Cosmed CPET. Os corredores correrão a 70% do VO2max em uma esteira não graduada por 2,5 h, com medições metabólicas feitas a cada 30 minutos. Água será fornecida ad libitum para todos os participantes, não sendo permitida nenhuma outra bebida ou comida. Imediatamente antes das sessões de laboratório sentado ou caminhando e da corrida de 2,5 horas, os participantes consumirão uma solução de 150 ml contendo 1 g de sacarose, 1 g de lactulose, 0,5 g de L-ramnose, 1 g de eritritol, 1 g de sucralose, 0,5 g de manitol .

A urina será coletada em recipientes plásticos por 24 h em duas frações separadas: 0-5 h e 5-24 h. Não será permitido comer ou beber (exceto água da torneira) durante as primeiras 5 horas de coleta de urina. Os participantes retornarão na manhã seguinte em jejum noturno, fornecerão uma amostra de sangue e entregarão amostras de urina.

Orientações para coleta de urina aos sujeitos:

• Você deve coletar cada gota de urina durante cada período de coleta (5 horas a partir do início da sessão de exercício e, em seguida, a segunda coleta durando até a manhã seguinte ou 5 a 24 horas a partir do início do exercício). Não importa quanta ou pouca urina é eliminada a cada vez, desde que cada gota seja coletada.
• Colete cada gota de urina durante o dia e a noite nos dois frascos de coleta (0-5 horas, 5-24 horas, começando com o início da sessão de teste de exercício laboratorial). Guarde as garrafas na geladeira. Certifique-se de coletar qualquer urina eliminada durante as evacuações.
• Termine coletando a primeira urina eliminada na manhã seguinte, adicionando-a ao frasco coletor. Traga os dois frascos de coleta de urina com você para o laboratório (ou seja, na manhã seguinte à sessão de exercícios, quando você fornecerá sua amostra de sangue final).

Suplemento de flavonoides: cápsulas de suplemento e placebo serão preparadas pelo Reoxcyn Innovation Group LLC (Salt Lake City, UT). (VER informações de suplementação no arquivo anexo). Os ingredientes serão os mesmos testados no ensaio comunitário: vitamina C (como palmitato de ascorbilo) (Green Wave Ingredients, La Mirada, CA), extrato de mirtilo selvagem (25% de antocianinas totais) (FutureCeuticals, Momence, IL), chá verde extrato de folha (50% EGCG) (Watson Industries, Inc., Pomona, CA), quercetina aglicona (Novel Ingredientes, East Hanover, NJ), cafeína (Creative Compounds, Scott City, MO) e ácidos graxos ômega 3 (Novotech Nutraceuticals , Ventura, CA). Os ingredientes e excipientes de enchimento da cápsula incluem Nu-Flow 70R (de casca de arroz), tapioca de raiz de mandioca, sílica de bambu natural, raiz de marshmallow. As cápsulas de placebo conterão apenas os ingredientes de preenchimento e excipientes (sem os ingredientes ativos). A dose diária para os caminhantes será de 2 flavonoides ou 2 cápsulas de placebo. Duas cápsulas de flavonoides fornecem 329 mg de flavonoides (a média do adulto americano, dependendo do estudo, é de 240 mg por dia). A dose diária para os corredores será de 4 cápsulas de flavonóides (658 mg de flavonóides). Os participantes receberão um suprimento de 2 semanas das cápsulas de flavonoides ou placebo, com instruções sobre como consumir diariamente em doses divididas (1 no café da manhã e 1 no almoço, ou dobrar essa quantidade para os corredores). Os participantes do estudo poderão adicionar uma cápsula extra por dia para aumentar o consumo se um ou dois dias de ingestão do suplemento forem perdidos. Os participantes do estudo irão ingerir 2 cápsulas (4 para os corredores) logo após fornecer a amostra de sangue durante a sessão de laboratório de caminhada/descanso (ou corrida).

AS CÁPSULAS DE SUPLEMENTO serão TESTADAS quanto ao conteúdo de flavonóides antes e depois do estudo pela Dra. Mary Ann Lila (NCSU, Plants for Human Health Institute, NCRC).

Análise metabolômica direcionada:

Os metabólitos fenólicos derivados do intestino serão purificados do plasma por SPE usando uma plataforma automatizada e um protocolo SPE de 96 poços interno (60mg, 3mL; Phenomenex) para extração de 100 μL de tecido. Todos os analitos foram previamente otimizados para eficiências de extração entre 80-100% de recuperações com CV≤10%. Os extratos serão separados e quantificados por cromatografia líquida tandem-MS/MS envolvendo metodologias previamente publicadas e validadas. Resumidamente, a análise HPLC-ESI-MS/MS será realizada usando um SCIEX UPLC acoplado 6500 + MS/MS-QTRAP™ equipado com uma fonte Turbo-V de ionização por electrospray (ESI) (sangue e metabólitos fecais), com amostras injetadas em um A coluna Kinetex PFP e o gradiente de fase móvel consistiam em 0,1% de ácido fórmico (v/v) em água (A) e 0,1% de ácido fórmico (v/v) em acetonitrila (B) e um tempo de separação de 24 min. O protocolo de análise de metabólitos direcionados foi otimizado e validado para detectar mais de 200 analitos que são quantificados em relação aos padrões sintéticos e comerciais autênticos em nossa biblioteca, com conjugados putativos da Fase II identificados usando perfis de fragmentação envolvendo 3-5 transições únicas. Isso envolve a varredura de mais de 1.000 transições correspondentes a conjugados de sulfato, glicuronídeo, metil e glicina. Essa metodologia SMRM foi previamente otimizada para o tratamento Rexocyn e fornece um método significativamente mais sensível do que os procedimentos tradicionais de varredura de reação múltipla (MRM), pois permite monitorar um número maior de transições por unidade de tempo, além de permitir parâmetros a serem utilizados para cada analito, resultando em maior sensibilidade. Finalmente, os metabólitos serão confirmados com base no tempo de retenção (usando padrões autênticos e sintetizados sempre que possível) e três ou mais transições de íons precursores para produtos. Curvas de calibração pareadas por matriz de sete pontos variando de 0 a 10 μM serão utilizadas para a análise de flavonoides ou de 0 a 50 μM para a análise de metabólitos fenólicos.

Permeabilidade Intestinal, Urina Lactulose/Rhamnose:

As concentrações de açúcar na urina serão determinadas por cromatografia líquida de alta pressão. A sacarose na urina de 0-5 h, a relação lactulose/ramnose (L/R) na urina de 0-5 h e a relação sucralose/eritritol (S/E) na urina de 5-24 h serão usadas como indicadores para gastroduodenal , permeabilidade do intestino delgado e grosso, respectivamente.