两种灌溉激活系统功效的定量评估

资格标准 研究人群包括 20 名患者（9 名女性和 11 名男性，年龄 19-66 岁），他们在伊斯坦布尔 Medipol 大学牙科学校的牙髓诊所就诊，对根尖周炎病变的牙齿进行非手术牙髓再治疗。 本研究包括 20 颗先前接受过根管治疗的牙齿，这些牙齿显示出慢性根尖周炎病变的临床和影像学证据。 放射学上，根尖射线可透性的直径范围为 2 至 7 毫米。 治疗后根尖周炎的牙齿在 2 年多前完成了牙髓治疗，需要再次治疗。 根管充填物的末端距离射线照相顶点 0-4 毫米，没有过度充填。 牙齿具有完整的冠状修复体，牙根填充材料没有明显暴露于口腔。 选定的牙齿具有足够的牙冠结构，可以用橡皮障充分隔离，并且没有牙周袋或深度超过 4 毫米的附着层。 排除标准也适用，如下：在过去 3 个月内接受过抗生素治疗或患有任何全身疾病的患者的牙齿，无法用橡皮障正确隔离的牙齿，没有冠状动脉封闭的牙齿，有牙周袋的牙齿深度 >4 毫米；和牙冠/牙根折裂的牙齿。 每个患者只包括一颗牙齿。

根管治疗程序和取样 在整个牙髓再治疗过程中使用橡皮障和无菌技术。 去除菌斑、橡皮障隔离后，用3%过氧化氢清洗手术区，用2.5% NaOCl溶液消毒。 然后，移除所有冠修复体、桩和龋齿缺损，并在根管充填物适当暴露时完成入路准备。 然后用2.5% NaOCl再次对牙齿（包括髓室）、夹具和相邻的橡皮障进行消毒，然后用10%硫代硫酸钠灭活以避免干扰细菌学取样。 无菌对照样品 (SR1) 使用带有可弹出头的无菌 Omni Swab（Whatman FTA，Sigma-Aldrich）从牙齿表面采集。 将纸点转移到含有磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液的冷冻管中，储存于 -20°C。 在每种情况下，都对单个根管进行采样，以便将微生物评估限制在单个生态环境中。 在多根牙中，选择具有根尖周病变的牙根。 如果所有牙根都有根尖周病变，则选择较宽的根管。 本研究纳入的根管中有 2 根来自单根牙，3 根是上颌前磨牙的颊根管，1 根来自上颌磨牙的腭根管，10 根来自下颌磨牙的远中根管。

使用 Gates-Glidden 钻头（Dentsply Maillefer，Ballaigues，Switzerland）和牙髓锉去除旧牙根填充物，不使用化学溶剂。 使用根尖定位器（Raypex6；VDW GmbH，慕尼黑，德国）确定距根尖孔短 1 毫米的工作长度 (WL)，然后拍摄根尖周 X 光片以确保去除所有填充材料。 用无菌盐水溶液冲洗以去除任何残留物质并在样品收集之前润湿管道。 接下来，在根管内充满生理盐水，在 WL 处放置一个小型手持器械，用于轻轻锉根管壁。 初始微生物样本 (S1) 从根管中取出，无菌纸点连续放置在 WL 处。 将三个无菌纸尖插入根管内进行取样。 每个纸点留在管内约 1 分钟。 纸尖和没有手柄的牙髓手持器械都被转移到含有 300 μl PBS 溶液的冷冻管中，储存于 -20°C。 样品被转移到基因分析实验室进行冷链进一步分析。

使用 Revo S 锉预备根管并用 2.5% NaOCl 冲洗。 根管根尖扩大至工作长度的 35 号 (AS35)。 在每次器械更换之间，使用 30 号侧通气针头用 5 毫升 2.5% NaOCl 溶液冲洗根管，针头距离工作长度 1 至 2 毫米。 因此，总共使用了 30 mL 的冲洗液。 仪器完成后，用 2 mL 17% EDTA 去除污迹层，将其留在根管中 3 分钟，然后用 2.5% NaOCl。 用无菌纸尖擦干根管并用 2 ml 10% 硫代硫酸钠冲洗 1 分钟以灭活 NaOCl 溶液。 接下来，如 S1 所述，从根管中取出样本 (S2)。 此后，如下所述搅动/活化NaOCl。

XPF 组：仪器 XP-Endo Finisher（FKG Dentaire，尺寸 #25，锥度 .00） 冷却下来（Endo-Frost；Roeko，Langenau，德国）以保持笔直并测量 WL。 根管用 2.5 mL 2.5% NaOCl 冲洗 30 秒，并由 XPF 仪器激活，该仪器放置在根管中距离 WL 1 毫米处，由电机以 800 rpm（1 N-cm 扭矩）驱动 30 秒根据制造商的说明（在连续旋转中以大约 7 毫米的幅度缓慢上下运动）。 然后用 2.5 mL 2.5% NaOCl 冲洗根管，然后用 XPF 仪器激活物质 30 秒，方法同上。 每个根管都使用了一个新的 XP-endo Finisher 文件。

EA 组：用 2.5 mL 的 2.5% NaOCl 冲洗根管 30 秒，然后使用 EndoActivator red tip size #25/0.04 对该溶液进行声波激活 (EA; Dentsply Tulsa Dental Specialties, Tulsa, OK)，以 10,000 cpm/min 的速度插入距 WL 短 1 mm 的根管中。 持续 30 秒。 在激活过程中，EA 聚合物尖端从根尖垂直移动到根管的冠状部分。 然后再次重复相同的程序（2.5 mL 的 2.5% NaOCl 的声波激活 30 秒），以便用 NaOCl 进行的总冲洗和使用测试装置的冲洗搅动时间为 1 分钟。 两组中每个根管使用的 NaOCl 总量均为 35 mL。 在两组中，均使用 5 mL NaOCl 并激活一分钟。

最后，将两组根管干燥并用2 mL 10%硫代硫酸钠冲洗1 min。 激活后样本 (S3) 的获取方式与收集激活前样本的方式相同，并送去进行 PCR 分析。 根管治疗完成后，使用牙胶的侧向浓缩进行牙根充填。 用复合树脂修复通路腔，并拍摄最终射线照片。 所有根管和微生物取样程序均由一名经验丰富的牙髓医生执行。 通过液滴数字聚合酶链反应 (ddPCR)，在使用仪器之前、使用仪器和使用灌溉激活系统后确定总细菌负荷以及粪肠球菌的数量。

总细菌载量以及粪肠球菌的量在仪器化之前、仪器化之后和使用管内药物时通过 ddPCR 进行测定。

基因组 DNA 分离和 DNA 浓度测量 按照制造商推荐的方案，使用 QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，德国）提取 DNA。 在 DNA 分离之前，样品（带纸尖的试管）在 50-60°C 下每 10 分钟涡旋消化 30 秒，以确保所有细菌分解到 PBS 溶液中。 然后，从悬浮液中无菌去除纸尖，并通过在 5000 g 下离心 10 分钟使细菌悬浮液沉淀。 然后将沉淀重悬于由 QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN GmbH，Hilden，Germany）提供的 180 µl 缓冲液 ATL 中，并添加 20 µl 蛋白酶 K（20 mg/ml）。 样品在 56°C 下孵育 3 小时。 随后，根据 QIAamp DNA Mini Kit 的方案分离总细菌基因组 DNA。 每个样品的 DNA 溶液的最终体积为 150 μL，并在计算过程中考虑在内。 用分光光度计（Promega Quantifluor）测定 DNA 浓度（260 nm 处的吸光度）。

16S rRNA 基因的扩增 本研究设计了通用和肠球菌 16S rRNA 基因的引物。 使用 QIAamp DNA Mini Kit 提取样品 DNA 后，使用通用 E8F 正向引物 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 和通用 E1115R 反向引物 (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3') 扩增 700-800 bp 的 16S rRNA 序列59. 将每个分离的细菌菌株的 PCR 反应的最终体积调整为 25 µl。 16S rRNA基因的扩增反应在以下条件下进行。 1 个 95°C 3 分钟预变性循环，35 个 95°C 30 秒、55°C 30 秒和 72°C 30 秒的循环，最后的延伸步骤是 72°C 10 分钟.

使用在 Tris/BoratE/EDTA (TBE) 缓冲液中的 2% 琼脂糖凝胶（含有溴化乙锭）通过电泳分析 PCR 产物，凝胶在紫外光下（在 140V 下 20 分钟）进行分析。 他们的图像在紫外线照射下可视化。 此外，用于ddPCR的引物的控制和优化也在常规PCR中进行。

16S rRNA 基因的纯化和测序 PCR 反应后，通过使用含有核酸外切酶 I 和碱性磷酸酶的 ExoSap-IT（Thermo，PN：78201.1.ML）水解多余的引物和核苷酸来纯化 PCR 产物。每个样品将 2 µl ExoSap-IT 与 5 µl PCR 产物混合。 ExoSap 反应在 37 °C 下进行 15 分钟（酶活化），然后在 80 °C 下进行 15 分钟（失活）。 使用 Bigdye™ Terminator v3.1 循环测序试剂盒 (Thermo) 进行测序反应。 根据所有分离菌株的试剂盒手册进行反应。

用Exosap纯化产物后，在以下条件下用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo)进行测序反应。 序列PCR后，BigDye产物通过结肠法纯化。 Zymo ZR DNA 测序清理试剂盒（Zymo Research，美国）用于此过程。 所有样品均按照试剂盒中提供的方案进行纯化，并在 3130XL 基因分析仪上执行。

微滴式数字 PCR (ddPCR) 微滴式数字 PCR (ddPCR) 是使用根据对总细菌和粪肠球菌物种特异的 16S rRNA 区域设计的引物进行的，在测序后，对纸点样本中发现的细菌物种进行绝对定量。 引物对为 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' 和 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3（用于总细菌）和 ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' 和 ENT-R-5'-GCCATGCGGCATAAACTG -3' 粪肠球菌的引物对。 在 PCR 反应中，通过用 Eva-Green 染料标记来分析用未标记的引物对扩增的扩增子。 对于肠球菌和总 16S rRNA 的绝对定量，使用来自同一样本的两个引物对进行 PCR。 20 µL PCR 混合物，包含 10 µL 2X ddPCR EvaGreen Supermix（Bio-Rad，猫。 不。 1864034)、9 µL 无核酸酶水、0.25 µL 正向和反向引物以及来自每个样品的 2 ng DNA 热循环条件为：95°C 5 分钟，然后 40 个 95°C 循环 30 秒和60°C 1 分钟，最后两个步骤在 4°C 5 分钟和 90°C 5 分钟，4°C 无限保持。 PCR 完成后，将密封的板转移到 QX200 液滴读数器（Bio-Rad，目录号 不。 1864003）。