Quantitative Bewertung der Wirksamkeit von zwei Bewässerungsaktivierungssystemen

Zulassungskriterien Die Studienpopulation bestand aus 20 Patienten (9 Frauen und 11 Männer im Alter von 19 bis 66 Jahren), die sich in der Endodontieklinik der Istanbul Medipol University Dental School zur nicht-chirurgischen endodontischen Nachbehandlung von Zähnen mit apikalen Parodontitisläsionen vorstellten. 20 zuvor wurzelkanalbehandelte Zähne mit klinischen und röntgenologischen Hinweisen auf chronische apikale Parodontitisläsionen wurden in diese Studie aufgenommen. Röntgenologisch lag der Durchmesser der periapikalen Aufhellung im Bereich von 2 bis 7 mm. Bei Zähnen mit apikaler Parodontitis nach der Behandlung war die endodontische Behandlung mehr als 2 Jahre zuvor abgeschlossen worden und es war eine erneute Behandlung erforderlich. Die Enden der Wurzelkanalfüllungen lagen zwischen 0 und 4 mm vor dem röntgenologischen Apex, ohne Überfüllung. Die Zähne hatten intakte koronale Restaurationen, ohne dass das wurzelfüllende Material offensichtlich der Mundhöhle ausgesetzt war. Ausgewählte Zähne hatten eine ausreichende Kronenstruktur für eine adäquate Isolation mit Kofferdam und zeigten keine parodontalen Taschen oder Attachmentniveaus, die tiefer als 4 mm waren. Es wurden auch folgende Ausschlusskriterien angewendet: Zähne von Patienten, die innerhalb der letzten 3 Monate Antibiotika erhalten hatten oder die an einer Allgemeinerkrankung litten, Zähne, die nicht richtig mit Kofferdam isoliert werden konnten, Zähne ohne Koronarversiegelung, Zähne mit parodontaler Tasche Tiefe >4 mm; und Zähne mit Kronen-/Wurzelfraktur. Von jedem Patienten wurde nur ein Zahn eingeschlossen.

Verfahren zur Wurzelkanalbehandlung und Probenentnahme Kofferdam und eine aseptische Technik wurden während der gesamten endodontischen Nachbehandlung angewendet. Nach Plaqueentfernung und Kofferdamisolierung wurde das Operationsfeld mit 3%igem Wasserstoffperoxid gereinigt und mit 2,5%iger NaOCl-Lösung desinfiziert. Anschließend wurden alle koronalen Restaurationen, Stifte und kariösen Defekte entfernt und die Zugangspräparation abgeschlossen, nachdem die Wurzelkanalfüllung korrekt freigelegt war. Anschließend wurden Zahn (inkl. Pulpakammer), Klemme und angrenzender Kofferdam noch einmal mit 2,5 % NaOCl desinfiziert, gefolgt von einer Inaktivierung mit 10 % Natriumthiosulfat, um eine Beeinträchtigung der bakteriologischen Probenahme zu vermeiden. Sterilitätskontrollproben (SR1) wurden mit einem sterilen Omni Swab (Whatman FTA, Sigma-Aldrich) mit auswerfbarem Kopf von der Zahnoberfläche entnommen. Papierspitzen wurden in Kryoröhrchen überführt, die eine bei –20°C gelagerte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthielten. In jedem Fall wurde ein einzelner Wurzelkanal beprobt, um die mikrobielle Bewertung auf eine einzige ökologische Umgebung zu beschränken. Bei mehrwurzeligen Zähnen wurde die Wurzel mit der periapikalen Läsion ausgewählt. Wenn es periapikale Läsionen in allen Wurzeln gab, wurde der breitere Kanal ausgewählt. Zwei der in diese Studie eingeschlossenen Kanäle stammten von einwurzeligen Zähnen, 3 waren bukkale Kanäle in Oberkiefer-Prämolaren, 1 Gaumenkanal in Oberkiefer-Molaren und 10 distale Kanäle in Unterkiefer-Molaren.

Alte Wurzelfüllungen wurden mit Gates-Glidden-Bohrern (Dentsply Maillefer, Ballaigues, Schweiz) und endodontischen Feilen ohne Verwendung chemischer Lösungsmittel entfernt. Die Arbeitslänge (WL) wurde 1 mm vor dem apikalen Foramen mit einem Apexlokator (Raypex6; VDW GmbH, München, Deutschland) bestimmt, und dann wurden periapikale Röntgenaufnahmen gemacht, um sicherzustellen, dass das gesamte Füllmaterial entfernt wurde. Es wurde eine Spülung mit steriler Kochsalzlösung durchgeführt, um alle verbleibenden Materialien zu entfernen und den Kanal vor der Probenentnahme zu befeuchten. Als nächstes wurde der Kanal mit Kochsalzlösung gefüllt belassen, und ein kleines Handinstrument wurde am WL platziert und verwendet, um die Kanalwände sanft zu feilen. Eine anfängliche mikrobiologische Probe (S1) wurde aus dem Wurzelkanal entnommen, wobei sterile Papierspitzen nacheinander am WL platziert wurden. Zur Probenahme wurden drei sterile Papierspitzen in den Wurzelkanal eingeführt. Jede Papierspitze wurde etwa 1 Minute im Kanal belassen. Sowohl die Papierspitzen als auch das endodontische Handinstrument ohne Griff wurden in Kryoröhrchen überführt, die 300 &mgr;l bei –20°C gelagerte PBS-Lösung enthielten. Die Proben wurden zur weiteren Analyse in der Kühlkette in ein Genanalyselabor überführt.

Die Wurzelkanäle wurden mit den Revo S-Feilen aufbereitet und mit 2,5 % NaOCl gespült. Die Kanäle wurden auf Arbeitslänge apikal auf Größe 35 (AS35) erweitert. Zwischen jedem Instrumentenwechsel wurde der Wurzelkanal mit 5 ml 2,5 %iger NaOCl-Lösung gespült, indem eine 30-Gauge-Nadel mit Seitenbelüftung verwendet wurde, die 1 bis 2 mm vor der Arbeitslänge platziert wurde. Daher wurden insgesamt 30 ml der Spüllösung verwendet. Nachdem die Instrumentierung abgeschlossen war, wurde die Schmierschicht mit 2 ml 17 % EDTA entfernt, das für 3 min im Kanal belassen wurde, gefolgt von 2,5 % NaOCl. Der Wurzelkanal wurde mit sterilen Papierspitzen getrocknet und 1 Minute lang mit 2 ml 10 % Natriumthiosulfat gespült, um die NaOCl-Lösung zu inaktivieren. Als nächstes wurde eine Probe (S2) aus den Kanälen entnommen, wie für S1 beschrieben. Anschließend wurde das NaOCl wie unten beschrieben bewegt/aktiviert.

XPF-Gruppe: Das Instrument XP-Endo Finisher (FKG Dentaire, Größe #25, Konus .00) wurde abgekühlt (Endo-Frost; Roeko, Langenau, Deutschland), um es gerade zu halten und die WL zu messen. Die Kanäle wurden mit 2,5 ml 2,5 % NaOCl für 30 s gespült und durch ein XPF-Instrument aktiviert, das 1 mm vor der WL in den Kanal eingeführt und 30 s lang vom Motor mit 800 U/min (1 N-cm Drehmoment) angetrieben wurde nach Herstellerangaben (in langsamen Auf- und Abbewegungen mit ca. 7 mm Amplitude in kontinuierlicher Rotation). Dann wurden die Kanäle mit 2,5 ml 2,5 % NaOCl gespült, gefolgt von einer Aktivierung der Substanz mit dem XPF-Instrument für 30 Sekunden auf die gleiche Weise wie oben. Für jeden Kanal wurde eine neue XP-endo Finisher Feile verwendet.

EA-Gruppe: Die Wurzelkanäle wurden mit 2,5 ml 2,5 % NaOCl für 30 s gespült, gefolgt von einer Schallaktivierung dieser Lösung mit EndoActivator Red Tip Größe #25/0,04 (EA; Dentsply Tulsa Dental Specialties, Tulsa, OK), 1 mm vor der WL in den Wurzelkanal eingeführt, bei 10.000 cpm/min. für 30 Sekunden. Die EA-Polymerspitze bewegte sich während der Aktivierung vertikal vom apikalen zum koronalen Teil des Kanals. Dann wurde das gleiche Verfahren noch einmal wiederholt (Schallaktivierung von 2,5 ml 2,5 % NaOCl für 30 Sekunden), so dass die Gesamtspülung mit NaOCl und Spülbewegungszeit mit den Testvorrichtungen 1 Minute betrugen. Das Gesamtvolumen an NaOCl, das pro Kanal in beiden Gruppen verwendet wurde, betrug 35 ml. In beiden Gruppen wurden 5 ml NaOCl verwendet und für eine Minute aktiviert.

Schließlich wurden die Kanäle in beiden Gruppen getrocknet und mit 2 ml 10 % Natriumthiosulfat für 1 Minute gespült. Die Probe nach der Aktivierung (S3) wurde auf die gleiche Weise wie die Probe vor der Aktivierung entnommen und zur PCR-Analyse geschickt. Zum Abschluss der Wurzelkanalbehandlung erfolgte die Wurzelfüllung mit lateraler Guttapercha-Kondensation. Die Zugangskavitäten wurden mit Kompositharz wiederhergestellt, und es wurde eine abschließende Röntgenaufnahme angefertigt. Alle Wurzelkanal- und Mikrobenentnahmeverfahren wurden von einem einzigen erfahrenen Endodontologen durchgeführt. Die Gesamtkeimbelastung sowie die Menge an Enterococcus faecalis wurden vor der Instrumentierung, nach der Instrumentierung und der Verwendung der Bewässerungsaktivierungssysteme mittels Tröpfchen-Digital-Polymerase-Kettenreaktion (ddPCR) bestimmt.

Die Gesamtkeimbelastung sowie die Menge an Enterococcus faecalis wurden vor der Instrumentierung, nach der Instrumentierung und der Anwendung der intrakanalalen Medikamente mittels ddPCR bestimmt.

Isolierung genomischer DNA und Messung der DNA-Konzentration DNA wurde unter Verwendung des QIAamp DNA Mini Kits (Qiagen, Deutschland) nach dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll extrahiert. Vor der DNA-Isolierung wurden die Proben (die Röhrchen mit Papierspitzen) bei 50–60 °C DURCH Vortexen alle 10 Minuten für 30 Sekunden verdaut, um die Desaggregation aller Bakterien in der PBS-Lösung sicherzustellen. Anschließend wurden die Papierspitzen aseptisch aus der Suspension entfernt und die Bakteriensuspension durch 10-minütige Zentrifugation bei 5000 g pelletiert. Das Pellet wurde dann in 180 &mgr;l Puffer ATL, geliefert von QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) resuspendiert und 20 &mgr;l Proteinase K (20 mg/ml) wurden hinzugefügt. Die Proben wurden für 3 h bei 56°C inkubiert. Anschließend wurde die gesamte bakterielle genomische DNA gemäß dem Protokoll des QIAamp DNA Mini Kits isoliert. Das Endvolumen der DNA-Lösung jeder Probe betrug 150 μL und wurde bei der Berechnung berücksichtigt. Die DNA-Konzentration (Absorption bei 260 nm) wurde mit einem Spektrophotometer (Promega Quantifluor) bestimmt.

Amplifikation von 16S-rRNA-Genen In dieser Studie wurden Primer für Universal- und Enterococcus-16S-rRNA-Gene entwickelt. Nach der DNA-Extraktion von Proben mit dem QIAamp DNA Mini Kit wurden 700–800 bp der 16S-rRNA-Sequenzen unter Verwendung des universellen E8F-Vorwärtsprimers (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') und des universellen E1115R-Rückwärtsprimers (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3') amplifiziert. 59. Das Endvolumen der PCR-Reaktionen für jeden isolierten Bakterienstamm wurde auf 25 &mgr;l eingestellt. Die Amplifikationsreaktionen von 16S-rRNA-Genen wurden unter den folgenden Bedingungen durchgeführt. 1 Vordenaturierungszyklus bei 95 °C für 3 Minuten, 35 Zyklen bei 95 °C für 30 Sekunden, 55 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden, die mit einem abschließenden Verlängerungsschritt bei 72 °C für 10 Minuten fortgesetzt werden .

Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese unter Verwendung von 2 % Agarosegel (enthaltend Ethidiumbromid) in Tris/BoratE/EDTA (TBE)-Puffer analysiert, wobei die Gele unter ultraviolettem Licht (bei 140 V für 20 Minuten) analysiert wurden. Ihre Bilder wurden unter ultravioletter Beleuchtung sichtbar gemacht. Darüber hinaus erfolgte die Kontrolle und Optimierung der für die ddPCR zu verwendenden Primer auch in der konventionellen PCR.

Reinigung und Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens Nach den PCR-Reaktionen erfolgt die Reinigung der PCR-Produkte durch Hydrolyse der überschüssigen Primer und Nukleotide mit ExoSap-IT (Thermo, PN: 78201.1.ML), das die Enzyme Exonuclease I und Alkalische Phosphatase enthält. 2 µl ExoSap-IT wurden mit 5 µl PCR-Produkt für jede Probe gemischt. Die ExoSap-Reaktion wird bei 37 °C für 15 Minuten (Enzymaktivierung) gefolgt von 15 Minuten (Inaktivierung) bei 80 °C durchgeführt. Die Sequenzierungsreaktionen wurden unter Verwendung des Bigdye TM Terminator v3.1-Zyklussequenzierungskits (Thermo) durchgeführt. Die Reaktionen wurden gemäß dem Kit-Handbuch für alle isolierten Stämme durchgeführt.

Nach der Reinigung der Produkte mit Exosap wurde die Sequenzreaktion mit dem BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt. Nach der Sequenz-PCR wurden BigDye-Produkte durch die Colon-Methode gereinigt. Für dieses Verfahren wurde das Zymo ZR DNA Sequencing Clean-up Kit (Zymo Research, USA) verwendet. Alle Proben wurden gemäß dem im Kit angegebenen Protokoll gereinigt und auf dem Genanalysator 3130XL durchgeführt.

Tröpfchen-Digital-PCR (ddPCR) Tröpfchen-Digital-PCR (ddPCR) wurde unter Verwendung von Primern durchgeführt, die gemäß der 16S-rRNA-Region entwickelt wurden, die spezifisch für die gesamten Bakterien- und Enterococcus faecalis-Spezies ist, nach Sequenzierung, absolute Quantifizierung der Bakterienspezies, die in der Papierpunktprobe gefunden wurden. Die Primerpaare waren 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' und 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 für Gesamtbakterien und ENT-F-5'-CGCTTCTTCCTCCCGAGT-3' und ENT-R-5'-GCCATGCGGCATAAACTG -3'-Primerpaare für Enterococcus Faecalis. In der PCR-Reaktion wurden mit unmarkierten Primerpaaren amplifizierte Amplikons durch Markierung mit Eva-Green-Farbstoff analysiert. Zur absoluten Quantifizierung von Enterococcus und Gesamt-16S-rRNA wurde eine PCR mit zwei Primerpaaren aus derselben Probe durchgeführt. 20 µl PCR-Mix mit 10 µl 2X ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad, Kat.-Nr. nein. 1864034), 9 µL Nuklease-freies Wasser, 0,25 µL Forward- und Reverse-Primer und 2 ng DNA aus jeder Probe Temperaturwechselbedingungen waren: 95 °C für 5 min, dann 40 Zyklen bei 95 °C für 30 s und 60◦C für 1 Minute und zwei abschließende Schritte bei 4◦C für 5 Minuten und 90◦C für 5 Minuten mit einem unendlichen Halten bei 4◦C. Nach Abschluss der PCR wurde die versiegelte Platte in den Plattenhalter des QX200 Droplet Reader (Bio-Rad, Kat. nein. 1864003).