Két öntözőrendszer hatékonyságának kvantitatív értékelése

Alkalmassági kritériumok A vizsgálati populáció 20 betegből állt (9 nő és 11 férfi, 19-66 évesek), akik az Isztambuli Medipol Egyetem Fogászati ​​Iskola endodontiai klinikáján jelentkeztek apikális parodontitises elváltozásokkal rendelkező fogak nem sebészeti endodontiai újrakezelésére. Ebbe a vizsgálatba 20 korábban gyökérkezeléssel kezelt fogat vontunk be, amelyek klinikai és radiográfiai bizonyítékot mutattak a krónikus apikális parodontitis elváltozásaira. Radiográfiailag a periapikális radiolucencia átmérője 2 és 7 mm között változott. A kezelés utáni apikális parodontitisben szenvedő fogakon több mint 2 évvel korábban fejeződött be az endodonciai kezelés, és újra kellett kezelni. A gyökértömések végei a radiográfiai csúcstól 0-4 mm-rel rövidebbek voltak, túltöltés nélkül. A fogakon ép koronális pótlások voltak, a gyökértömő anyag nyilvánvalóan nem került a szájüregbe. A kiválasztott fogak megfelelő koronaszerkezettel rendelkeztek ahhoz, hogy megfelelő szigetelést biztosítsanak egy gumidámlással, és hiányzik a parodontális zseb, vagy 4 mm-nél mélyebb rögzítési szint. Kizárási kritériumokat is alkalmaztunk, az alábbiak szerint: olyan betegek fogai, akik az elmúlt 3 hónapban antibiotikumot kaptak, vagy bármilyen általános betegségben szenvedtek, gumitömítéssel nem megfelelően izolálható fogak, koszorúér-tömítés hiányos fogak, parodontális zsebes fogak mélység >4 mm; és korona/gyökér töréses fogak. Minden páciensből csak egy fog került be.

Gyökérkezelési eljárások és mintavétel Gumigát és aszeptikus technikát alkalmaztunk az endodonciai újrakezelés során. A lepedék eltávolítása és a gumigát izolálása után a műtéti területet 3%-os hidrogén-peroxiddal tisztítottuk és 2,5%-os NaOCl oldattal fertőtlenítettük. Ezután minden koronális pótlást, oszlopot és szuvas defektust eltávolítottak, és a hozzáférés előkészítése befejeződött, amikor a gyökércsatorna tömést megfelelően feltárták. Ezt követően a fogat (beleértve a pulpakamrát), a szorítót és a szomszédos gumidugaszt még egyszer fertőtlenítettük 2,5%-os NaOCl oldattal, majd 10%-os nátrium-tioszulfáttal inaktiváltuk, hogy elkerüljük a bakteriológiai mintavétel zavarását. Sterilitási kontroll mintákat (SR1) vettünk a fogfelszínről egy steril Omni tamponnal (Whatman FTA, Sigma-Aldrich) kilökhető fejjel. A papírhegyeket -20 °C-on tárolt foszfáttal pufferolt sóoldatot (PBS) tartalmazó kriocsövekbe vittük át. Minden esetben egyetlen gyökércsatornából vettünk mintát, hogy a mikrobiális értékelést egyetlen ökológiai környezetre korlátozzuk. Többgyökerű fogaknál a periapicalis elváltozással rendelkező gyökeret választottuk ki. Ha minden gyökérben periapikális elváltozások voltak, a szélesebb csatornát választottuk. A vizsgálatba bevont csatornák közül kettő egygyökerű fogakból származott, 3 bukkális csatorna a maxilláris premolarisban, 1 palatális csatorna a felső őrlőfogban és 10 disztális csatorna a mandibularis őrlőfogban.

A régi gyökértöméseket Gates-Glidden fúrókkal (Dentsply Maillefer, Ballaigues, Svájc) és endodonciai reszelőkkel távolítottuk el kémiai oldószerek használata nélkül. A munkahosszt (WL) az apikális foramentől 1 mm-re apex lokátorral (Raypex6; VDW GmbH, München, Németország) határoztuk meg, majd periapikális röntgenfelvételeket készítettünk annak biztosítására, hogy minden tömőanyagot eltávolítsunk. Steril sóoldattal végzett öntözést végeztünk a visszamaradt anyagok eltávolítása és a csatorna megnedvesítése érdekében a mintavétel előtt. Ezután a csatornát megtöltötték sóoldattal, és egy kis kézi műszert helyeztek a WL-re, és finoman reszelték a csatorna falait. Egy kezdeti mikrobiológiai mintát (S1) vettünk a gyökércsatornából steril papírhegyekkel, egymást követően a WL-ben. A gyökércsatornába három steril papírpont került a mintavételhez. Minden papírpontot körülbelül 1 percig hagytak a csatornában. Mind a papírhegyeket, mind az endodonciai kézi műszert, fogantyú nélkül, 300 μl PBS-oldatot tartalmazó, -20°C-on tárolt kriocsövekbe vittük át. A mintákat genetikai analízis laboratóriumba szállították további hidegláncban történő elemzés céljából.

A gyökércsatornákat Revo S reszelőkkel készítettük el, és 2,5%-os NaOCl-al öntöztük. A csatornákat apikálisan 35-ös méretűre (AS35) növeltük a munkahosszon. Minden műszercsere között a gyökércsatornát 5 ml 2,5%-os NaOCl-oldattal öntöztük 30-as, oldalsó szellőzős tűvel, amelyet 1-2 mm-rel a munkahossztól távolabb helyeztünk el. Ezért összesen 30 ml öntözőoldatot használtunk fel. A műszerezés befejezése után a kenetréteget 2 ml 17%-os EDTA-val eltávolítottuk, amelyet 3 percig a csatornában hagytunk, majd 2,5%-os NaOCl-dal. A gyökércsatornát steril papírhegyekkel szárítottuk, és 2 ml 10%-os nátrium-tioszulfáttal öblítettük 1 percig, hogy inaktiváljuk a NaOCl-oldatot. Ezután mintát (S2) vettünk a csatornákból az S1-nél leírtak szerint. Ezt követően a NaOCl-ot az alábbiakban leírtak szerint kevertük/aktiváltuk.

XPF csoport: XP-Endo Finisher műszer (FKG Dentaire, #25-ös méret, kúpos 0,00) lehűtöttük (Endo-Frost; Roeko, Langenau, Németország), hogy egyenesen tartsa és mérje a WL-t. A csatornákat 2,5 ml 2,5%-os NaOCl-oldattal öblítettük 30 másodpercig, és egy XPF műszerrel aktiváltuk, amelyet a csatornába helyeztek 1 mm távolságra a WL-től, és 800 ford./perc (1 N-cm nyomaték) motorral hajtottuk 30 másodpercig. a gyártó utasításai szerint (lassú fel-le mozgásban, kb. 7 mm amplitúdóval folyamatos forgásban). Ezután a csatornákat 2,5 ml 2,5%-os NaOCl-oldattal öblítettük, majd az anyagot XPF műszerrel 30 másodpercig aktiváltuk a fent leírt módon. Minden csatornához új XP-endo Finisher fájlt használtak.

EA csoport: A gyökércsatornákat 2,5 ml 2,5%-os NaOCl-oldattal öntöztük 30 másodpercig, majd ezt az oldatot szonikus aktiválással 25/0,04 méretű EndoActivator piros hegyével (EA; Dentsply Tulsa Dental Specialties, Tulsa, OK), behelyezve a gyökércsatornába 1 mm távolságra a WL-től, 10 000 cpm/perc sebességgel. 30 másodpercig. Az EA polimer hegye függőlegesen elmozdult a csatorna csúcsától a koronális rész felé az aktiválás során. Ezután ugyanezt az eljárást még egyszer megismételtük (2,5 ml 2,5%-os NaOCl hangaktiválása 30 másodpercig), így a teljes NaOCl-os öntözés és a vizsgálóeszközökkel végzett irrigációs keverési idő 1 perc volt. A csatornánként felhasznált NaOCl teljes térfogata mindkét csoportban 35 ml volt. Mindkét csoportban 5 ml NaOCl-t használtunk, és egy percig aktiváltuk.

Végül mindkét csoport csatornáit megszárítottuk, és 2 ml 10%-os nátrium-tioszulfáttal 1 percig öblítettük. Az aktiválás utáni mintát (S3) ugyanúgy vettük, mint az aktiválás előtti mintát, és elküldtük a PCR elemzésre. A gyökérkezelés befejezése a guttapercha oldalsó kondenzációjával végzett gyökértöméssel történt. A hozzáférési üregeket kompozit gyantával helyreállítottuk, és egy végső röntgenfelvételt készítettek. Az összes gyökérkezelési és mikrobiális mintavételi eljárást egyetlen tapasztalt endodontológus végezte. A teljes bakteriális terhelést, valamint az Enterococcus faecalis mennyiségét a műszerezés előtt, a műszerezés és az irrigációs aktiváló rendszerek használata után cseppecskés digitális polimeráz láncreakcióval (ddPCR) határoztuk meg.

A teljes bakteriális terhelést, valamint az Enterococcus faecalis mennyiségét a műszerezés előtt, a műszerezés és az intracanalis gyógyszerek alkalmazása után határoztuk meg ddPCR segítségével.

A genomi DNS izolálása és a DNS-koncentráció mérése A DNS-t a QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Németország) segítségével extraháltuk a gyártó által javasolt protokoll szerint. A DNS-izolálás előtt a mintákat (a papírhegyű csöveket) 50-60°C-on 10 percenként 30 másodpercig vortexelve emésztjük, hogy biztosítsuk az összes baktérium szétesését a PBS-oldatban. Ezt követően a papírhegyeket aszeptikusan eltávolítottuk a szuszpenzióból, és a baktériumszuszpenziót 10 perces, 5000 g-vel végzett centrifugálással ülepítettük. A pelletet ezután a QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Németország) által szállított 180 µl ATL pufferben újraszuszpendáltuk, és 20 µl proteináz K-t (20 mg/ml) adtunk hozzá. A mintákat 3 órán át 56 °C-on inkubáltuk. Ezt követően a teljes bakteriális genomiális DNS-t izoláltuk a QIAamp DNA Mini Kit protokollja szerint. Az egyes minták DNS-oldatának végső térfogata 150 μl volt, és ezt figyelembe vettük a számítás során. A DNS-koncentrációt (abszorbancia 260 nm-en) spektrofotométerrel (Promega Quantifluor) határoztuk meg.

16S rRNS gének amplifikációja Ebben a vizsgálatban a Universal és Enterococcus 16S rRNS gének primerjeit terveztük. A minták QIAamp DNA Mini Kittel történő DNS-extrahálása után 700-800 bp 16S rRNS szekvenciát amplifikáltunk univerzális E8F forward primer (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') és univerzális E1115R reverz primer (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3') felhasználásával. 59. A PCR-reakciók végső térfogatát minden egyes izolált baktériumtörzs esetében 25 µl-re állítottuk be. A 16S rRNS gének amplifikációs reakcióit az alábbi körülmények között végeztük. 1 elődenaturálási ciklus 95 °C-on 3 percig, 35 ciklus 95 °C-on 30 másodpercig, 55 °C-on 30 másodpercig és 72 °C-on 30 másodpercig, amelyek egy utolsó meghosszabbítási lépéssel folytatódnak 72 °C-on 10 percig .

A PCR-termékeket elektroforézissel elemeztük 2%-os agaróz géllel (amely etidium-bromidot tartalmaz) Tris/BoratE/EDTA (TBE) pufferben, a géleket ultraibolya fényben (140 V-on 20 percig) analizáltuk. Képeiket ultraibolya megvilágítás mellett vizualizálták. Ezenkívül a ddPCR-hez használt primerek szabályozását és optimalizálását hagyományos PCR-ben is elvégezték.

A 16S rRNS gén tisztítása és szekvenálása A PCR reakciókat követően a PCR termékek tisztítása a feleslegben lévő primerek és nukleotidok ExoSap-IT (Thermo, PN: 78201.1.ML) Exonukleáz I-et és Alkaline Fosphatase enzimeket tartalmazó hidrolízisével történik. Minden mintához 2 µl ExoSap-IT-t kevertünk össze 5 µl PCR-termékkel. Az ExoSap reakciót 37 °C-on 15 percig végezzük (enzimaktiválás), majd 15 percig (inaktiválás) 80 °C-on. A szekvenálási reakciókat Bigdye™ Terminator v3.1 ciklusszekvenáló készlettel (Thermo) végeztük. A reakciókat a kit kézikönyve szerint hajtottuk végre minden izolált törzs esetében.

A termékek Exosap-pal történő tisztítása után a szekvenciareakciót BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit-tel (Thermo) hajtottuk végre a következő körülmények között. A szekvencia PCR után a BigDye termékeket vastagbél módszerrel tisztítottuk. Ehhez a folyamathoz Zymo ZR DNS Sequencing Clean-up Kit (Zymo Research, USA) használtunk. Az összes mintát a kitben megadott protokoll szerint tisztítottuk, és a 3130XL genetikai analizátorral végeztük.

Droplet Digital PCR (ddPCR) A Droplet Digital PCR (ddPCR) az összbaktériumra és az Enterococcus faecalis fajokra specifikus 16S rRNS-régió szerint tervezett primerek felhasználásával készült, szekvenálás után abszolút mennyiségi meghatározás a papírpontos mintában található baktériumfajokból. A primerpárok a 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' és a 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 voltak az összes baktériumhoz, valamint az ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' és ENT-R-5'-GCCATATGCGG. -3' primer párok Enterococcus Faecalis számára. A PCR reakcióban a jelöletlen primerpárokkal amplifikált amplikonokat Eva-Green festékkel történő jelöléssel elemeztük. Az Enterococcus és a teljes 16S rRNS abszolút mennyiségi meghatározásához PCR-t végeztünk két primerpárral, ugyanabból a mintából. 20 µl PCR keverék, amely 10 µL 2X ddPCR EvaGreen Supermix-et (Bio-Rad, kat. nem. 1864034), 9 µl nukleázmentes víz, 0,25 µl forward és reverse primer és 2 ng DNS minden mintából A termikus ciklus feltételei a következők voltak: 95 ◦ C 5 percig, majd 40 ciklus 95 ◦ C 30 másodpercig és 60 °C 1 percig és két utolsó lépés 4 °C-on 5 percig és 90 °C-on 5 percig 4 °C-os végtelen tartás mellett. A PCR befejezése után a lezárt lemezt áthelyeztük a QX200 Droplet Reader (Bio-Rad, kat.) lemeztartójába. nem. 1864003).