Kvantitativ vurdering af effektiviteten af ​​to kunstvandingsaktiveringssystemer

Berettigelseskriterier Undersøgelsespopulationen bestod af 20 patienter (9 kvinder og 11 mænd i alderen 19-66 år), der præsenterede for endodontisk klinik på Istanbul Medipol University Dental School for ikke-kirurgisk endodontisk genbehandling af tænder med apikale parodontitis læsioner. 20 tidligere rodkanalbehandlede tænder, der udviser kliniske og radiografiske tegn på kroniske apikale parodontitis læsioner, blev inkluderet i denne undersøgelse. Radiografisk varierede diameteren af ​​den periapikale radiolucens fra 2 til 7 mm. Tænder med apikal parodontitis efter behandling havde endodontisk behandling afsluttet mere end 2 år tidligere og krævede genbehandling. Enderne af rodkanalfyldningerne lå fra 0-4 mm fra den radiografiske apex, uden overfyldning. Tænderne havde intakte koronale restaureringer, uden nogen tydelig eksponering af det rodfyldende materiale til mundhulen. Udvalgte tænder havde nok kronestruktur til tilstrækkelig isolering med en gummidæmning og viste fravær af periodontale lommer eller fastgørelsesniveau dybere end 4 mm. Udelukkelseskriterier blev også anvendt som følger: tænder fra patienter, der havde fået antibiotika inden for de foregående 3 måneder, eller som havde en generel sygdom, tænder, der ikke kunne isoleres ordentligt med gummidæmning, tænder uden koronar tætning, tænder med periodontal lomme dybde >4 mm; og tænder med krone/rodbrud. Der blev kun inkluderet én tand fra hver patient.

Rodbehandlingsprocedurer og prøveudtagning Gummidæmning og en aseptisk teknik blev brugt under hele den endodontiske genbehandling. Efter plakfjernelse og gummidæmningsisolering blev operationsfeltet renset med 3% hydrogenperoxid og desinficeret med 2,5% NaOCl-opløsning. Derefter blev alle koronale restaureringer, stolper og kariesdefekter fjernet, og adgangsforberedelse blev afsluttet, når rodkanalfyldningen var ordentligt frilagt. Derefter blev tanden (inklusive pulpakammeret), klemmen og den tilstødende gummidæmning igen desinficeret med 2,5% NaOCl efterfulgt af inaktivering med 10% natriumthiosulfat for at undgå interferens med bakteriologisk prøveudtagning. Sterilitetskontrolprøver (SR1) blev taget fra tandoverfladen med en steril Omni Swab (Whatman FTA, Sigma-Aldrich) med et udkastbart hoved. Papirpunkter blev overført til kryorør indeholdende phosphatpufret saltvandsopløsning (PBS) opbevaret ved -20°C. I hvert tilfælde blev der udtaget en enkelt rodkanal for at begrænse den mikrobielle evaluering til et enkelt økologisk miljø. I multirodede tænder blev roden med den periapikale læsion udvalgt. Hvis der var periapikale læsioner i alle rødder, blev den bredere kanal valgt. To af kanalerne inkluderet i denne undersøgelse var fra enkeltrodede tænder, 3 var bukkale kanaler i maksillære præmolarer, 1 palatalkanal i maxillære molarer og 10 distale kanaler i mandibular kindtænder.

Gamle rodfyldninger blev fjernet ved hjælp af Gates-Glidden bor (Dentsply Maillefer, Ballaigues, Schweiz) og endodontiske filer uden brug af kemiske opløsningsmidler. Arbejdslængden (WL) blev etableret 1 mm kort fra det apikale foramen med en apex-locator (Raypex6; VDW GmbH, München, Tyskland), og derefter blev der taget periapikale røntgenbilleder for at sikre, at alt fyldmateriale blev fjernet. Irrigation med steril saltvandsopløsning blev udført for at fjerne eventuelle resterende materialer og for at fugte kanalen før prøvetagning. Dernæst blev kanalen efterladt fyldt med saltvand, og et lille håndinstrument blev placeret ved WL og brugt til forsigtigt at file kanalens vægge. En indledende mikrobiologisk prøve (S1) blev taget fra rodkanalen med sterile papirpunkter anbragt fortløbende ved WL. Tre sterile papirpunkter blev indsat i rodkanalen til prøveudtagning. Hvert papirpunkt blev efterladt i kanalen i ca. 1 minut. Både papirspidserne og det endodontiske håndinstrument uden håndtaget blev overført til kryorør indeholdende 300 μl PBS-opløsning opbevaret ved -20°C. Prøverne blev overført til genetisk analyselaboratorium for yderligere analyse i kølekæde.

Rodkanaler blev forberedt ved at bruge Revo S-filerne og vandede med 2,5% NaOCl. Kanalerne blev apikalt forstørret til størrelse 35 (AS35) i arbejdslængden. Mellem hvert instrumentskift blev rodkanalen skyllet med 5 ml 2,5 % NaOCl-opløsning ved at bruge en 30-gauge sideventileret nål, som blev placeret 1 til 2 mm kortere end arbejdslængden. Derfor blev der brugt i alt 30 ml af skylleopløsningen. Efter at instrumenteringen var afsluttet, blev udstrygningslaget fjernet med 2 ml 17% EDTA, som blev efterladt i kanalen i 3 minutter, efterfulgt af 2,5% NaOCl. Rodkanalen blev tørret med sterile papirspidser og skyllet med 2 ml 10% natriumthiosulfat i 1 minut for at inaktivere NaOCl-opløsningen. Derefter blev der taget en prøve (S2) fra kanalerne som beskrevet for S1. Efter dette blev NaOCl omrørt/aktiveret som beskrevet nedenfor.

XPF-gruppe: Instrumentet XP-Endo Finisher (FKG Dentaire, størrelse #25, taper .00) blev kølet ned (Endo-Frost; Roeko, Langenau, Tyskland) for at holde den ved lige og måle WL. Kanalerne blev skyllet med 2,5 ml 2,5 % NaOCl i 30 s og aktiveret af et XPF-instrument, der blev placeret i kanalen til 1 mm kort fra WL og drevet af motoren ved 800 rpm (1 N-cm moment) i 30 s. i henhold til producentens instruktioner (i langsomme op-og-ned-bevægelser ved ca. 7 mm amplitude i kontinuerlig rotation). Derefter blev kanalerne skyllet med 2,5 ml 2,5 % NaOCl efterfulgt af aktivering af stoffet med XPF-instrumentet i 30 sekunder på samme måde som ovenfor. En ny XP-endo Finisher-fil blev brugt til hver kanal.

EA-gruppe: Rodkanalerne blev skyllet med 2,5 ml 2,5% NaOCl i 30 s, efterfulgt af sonisk aktivering af denne opløsning med EndoActivator rød spids størrelse #25/0,04 (EA; Dentsply Tulsa Dental Specialties, Tulsa, OK), indsat i rodkanalen 1 mm fra WL ved 10.000 cpm/min. i 30 sekunder. EA-polymerspidsen bevægede sig lodret fra den apikale til den koronale del af kanalen under aktivering. Derefter blev den samme procedure gentaget endnu en gang (sonisk aktivering af 2,5 ml 2,5% NaOCl i 30 sekunder), således at den samlede skylning med NaOCl og skylleomrøringstid med testanordningerne var 1 min. Det totale volumen af ​​NaOCl anvendt pr. kanal i begge grupper var 35 ml. I begge grupper blev 5 ml NaOCl anvendt og aktiveret i et minut.

Til sidst blev kanalerne i begge grupper tørret og skyllet med 2 ml 10% natriumthiosulfat i 1 min. Postaktiveringsprøven (S3) blev opnået på samme måde som præaktiveringsprøven blev opsamlet og sendt til PCR-analyse. Afslutning af rodbehandlingen fortsatte med rodfyldning ved hjælp af lateral kondensering af guttaperka. Adgangshulrum blev genoprettet med kompositharpiks, og der blev taget et sidste røntgenbillede. Alle rodkanalen og mikrobielle prøveudtagningsprocedurer blev udført af en enkelt erfaren endodontist. Samlet bakteriel belastning samt mængden af ​​Enterococcus faecalis blev bestemt før instrumentering, efter instrumentering og brug af irrigationsaktiveringssystemerne ved hjælp af dråbereaktion med digital polymerasekædereaktion (ddPCR).

Den samlede bakteriemængde samt mængden af ​​Enterococcus faecalis blev bestemt før instrumentering, efter instrumentering og brug af de intracanale medikamenter ved hjælp af ddPCR.

Genomisk DNA-isolering og måling af DNA-koncentration DNA blev ekstraheret ved hjælp af QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Tyskland) efter den protokol, der anbefales af producenten. Før DNA-isolering blev prøver (rørene med papirspidser) fordøjet ved 50-60 °C VED hvirveldannelse i 30 sekunder i hvert 10. minut for at sikre disaggregering af alle bakterier i PBS-opløsningen. Bagefter blev papirspidserne fjernet aseptisk fra suspensionen, og bakteriesuspensionen blev pelleteret ved centrifugering i 10 minutter ved 5000 g. Pelleten blev derefter resuspenderet i 180 µl buffer ATL leveret af QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Tyskland), og 20 µl proteinase K (20 mg/ml) blev tilsat. Prøver blev inkuberet i 3 timer ved 56°C. Efterfølgende blev total bakteriel genomisk DNA isoleret i henhold til protokollen for QIAamp DNA Mini Kit. Det endelige volumen af ​​DNA-opløsning af hver prøve var 150 μL og blev taget i betragtning under beregningen. DNA-koncentration (absorbans ved 260 nm) blev bestemt med et spektrofotometer (Promega Quantifluor).

Amplifikation af 16S rRNA gener Primere for Universal og Enterococcus 16S rRNA gener blev designet i denne undersøgelse. Efter DNA-ekstraktion af prøver med QIAamp DNA Mini Kit blev 700-800 bp af 16S rRNA-sekvenser amplificeret ved at bruge universel E8F fremad primer (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') og universel E1115R revers primer (5'-AGGGGTTG3'CT) 59. Det endelige volumen af ​​PCR-reaktioner for hver isoleret bakteriestamme blev justeret til 25 µl. Amplifikationsreaktionerne af 16S rRNA-gener blev udført med følgende betingelser. 1 cyklus med prædenaturering ved 95°C i 3 minutter, 35 cykler af 95°C i 30 sekunder, 55°C i 30 sekunder og 72°C i 30 sekunder, som fortsætter med et sidste forlængelsestrin ved 72°C i 10 minutter .

PCR-produkterne blev analyseret ved elektroforese under anvendelse af 2% agarosegel (indeholdende ethidiumbromid) i Tris/BoratE/EDTA (TBE) buffer, hvor geler blev analyseret under ultraviolet lys (ved 140V i 20 minutter). Deres billeder blev visualiseret under ultraviolet belysning. Derudover blev kontrollen og optimeringen af ​​primere til brug for ddPCR også udført i konventionel PCR.

Oprensning og sekventering af 16S rRNA-genet Efter PCR-reaktionerne udføres oprensningen af ​​PCR-produkter ved at hydrolysere de overskydende primere og nukleotider med ExoSap-IT (Thermo, PN: 78201.1.ML) indeholdende Exonuclease I og Alkaline Phosphatase enzymer. 2 µl ExoSap-IT blev blandet med 5 µl PCR-produkt for hver prøve. ExoSap-reaktionen udføres ved 37 °C i 15 minutter (enzymaktivering) efterfulgt af 15 minutter (inaktivering) ved 80 °C. Sekvenseringsreaktioner blev udført ved at bruge Bigdye™ Terminator v3.1 cyklussekventeringskit (Thermo). Reaktionerne blev udført i overensstemmelse med kitmanualen for alle isolerede stammer.

Efter oprensning af produkterne med Exosap blev sekvensreaktionen udført med BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo) under følgende betingelser. Efter sekvens-PCR blev BigDye-produkter oprenset ved kolonmetoden. Zymo ZR DNA Sequencing Clean-up Kit (Zymo Research, USA) blev brugt til denne proces. Alle prøver blev oprenset i overensstemmelse med protokollen givet i sættet og udført på 3130XL genetisk analysator.

Droplet Digital PCR (ddPCR) Droplet Digital PCR (ddPCR) blev udført ved hjælp af primere designet i henhold til 16S rRNA-regionen, der er specifik for de totale bakterier og Enterococcus faecalis-arter, efter sekventering, absolut kvantificering fra bakteriearterne fundet i papirpunktprøven. Primerpar var 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' og 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 for totale bakterier og ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' og ENT-R-5'-GCCACATGCGGCATA -3' primerpar for Enterococcus Faecalis. I PCR-reaktionen blev amplikoner amplificeret med umærkede primerpar analyseret ved mærkning med Eva-Green farvestof. Til absolut kvantificering af Enterococcus og totalt 16S rRNA blev PCR udført med to primerpar fra den samme prøve. 20 µL PCR-blanding indeholdende 10 µL 2X ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad, kat. ingen. 1864034), 9 µL nukleasefrit vand, 0,25 µL af både fremadgående og reverse primer og 2 ng DNA fra hver prøve. Termiske cyklusforhold var: 95◦C i 5 minutter, derefter 40 cyklusser af 95◦C i 30 s. 60◦C i 1 min og to sidste trin ved 4◦C i 5 minutter og 90◦C i 5 minutter med 4◦C uendeligt hold. Efter at PCR var afsluttet, blev den forseglede plade overført til pladeholderen på QX200 Droplet Reader (Bio-Rad, kat. ingen. 1864003).