Kahden kasteluaktivointijärjestelmän tehokkuuden kvantitatiivinen arvio

Kelpoisuuskriteerit Tutkimuspopulaatio koostui 20 potilaasta (9 naista ja 11 miestä, iältään 19-66 vuotta), jotka saapuivat Istanbulin Medipolin yliopiston hammaslääkärikoulun endodontian klinikalle apikaalisten parodontiittivaurioiden hampaiden ei-kirurgiseen endodontiaan. Tähän tutkimukseen sisältyi 20 aiemmin juurihoidolla käsiteltyä hammasta, joilla oli kliinisiä ja radiografisia todisteita kroonisista apikaalisista parodontiittivaurioista. Radiografisesti periapikaalisen radioluenssin halkaisija vaihteli välillä 2-7 mm. Hampailla, joilla oli hoidon jälkeinen apikaalinen parodontiitti, endodonttinen hoito oli suoritettu yli 2 vuotta aikaisemmin ja ne vaativat uudelleenhoitoa. Juurikanavatäytteiden päät vaihtelivat 0-4 mm radiografisesta kärjestä, ilman ylitäyttöä. Hampaissa oli ehjät sepelvaltimot, eikä juuritäytemateriaalia näkynyt selvästi suuontelossa. Valituissa hampaissa oli tarpeeksi kruunurakennetta riittävään eristykseen kumipadolla, ja niissä ei havaittu parodontaalitaskuja tai kiinnitystasoa syvemmällä kuin 4 mm. Poissulkemiskriteereitä sovellettiin myös seuraavasti: hampaat potilailta, jotka olivat saaneet antibiootteja viimeisen 3 kuukauden aikana tai joilla oli jokin yleinen sairaus, hampaat, joita ei voitu eristää kunnolla kumiemolla, hampaat, joissa ei ollut sepelvaltimon tiivistettä, hampaat, joissa on periodontaalitasku syvyys > 4 mm; ja hampaat, joissa on kruunun/juuren murtuma. Jokaiselta potilaalta oli mukana vain yksi hammas.

Juurihoitotoimenpiteet ja näytteenotto Kumipatoa ja aseptista tekniikkaa käytettiin koko endodontian uudelleenhoidon ajan. Plakin poiston ja kumipadon eristämisen jälkeen leikkausalue puhdistettiin 3 % vetyperoksidilla ja desinfioitiin 2,5 % NaOCl-liuoksella. Sitten kaikki koronaaliset täytteet, tolpat ja kariesvauriot poistettiin ja pääsyn valmistelu saatiin päätökseen, kun juurikanavatäyte oli kunnolla esillä. Jälkeenpäin hammas (mukaan lukien massakammio), puristin ja viereinen kumisulku desinfioitiin jälleen 2,5-prosenttisella NaOCl:lla, mitä seurasi inaktivointi 10-prosenttisella natriumtiosulfaatilla bakteriologisen näytteenoton häiritsemisen välttämiseksi. Steriilisyyskontrollinäytteet (SR1) otettiin hampaan pinnalta steriilillä Omni Swab -puikolla (Whatman FTA, Sigma-Aldrich), jossa oli irrotettava pää. Paperikärjet siirrettiin kryoputkiin, jotka sisälsivät fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), jota säilytettiin -20 °C:ssa. Kussakin tapauksessa otettiin näyte yhdestä juurikanavasta mikrobiarvioinnin rajoittamiseksi yhteen ekologiseen ympäristöön. Monijuurisissa hampaissa valittiin juuri, jossa oli periapikaalinen vaurio. Jos kaikissa juurissa oli periapikaalisia vaurioita, valittiin leveämpi kanava. Kaksi tähän tutkimukseen sisältyneistä kanavista oli yksijuurisista hampaista, 3 poskikanavaa yläleuan esihampaissa, 1 palataalinen kanava poskihampaissa ja 10 distaalikanavaa alaleuan poskihampaissa.

Vanhat juuritäytteet poistettiin Gates-Glidden-poroilla (Dentsply Maillefer, Ballaigues, Sveitsi) ja endodontisilla viiloilla ilman kemiallisia liuottimia. Työpituus (WL) määritettiin 1 mm lyhyemmäksi apikaalisesta aukosta huippupaikantimella (Raypex6; VDW GmbH, München, Saksa), ja sitten otettiin periapikaaliset röntgenkuvat sen varmistamiseksi, että kaikki täytemateriaali oli poistettu. Kastelu steriilillä suolaliuoksella suoritettiin jäljellä olevien materiaalien poistamiseksi ja kanavan kostuttamiseksi ennen näytteenottoa. Seuraavaksi kanava jätettiin täytetyksi suolaliuoksella ja pieni käsiinstrumentti asetettiin WL:ään ja sitä käytettiin viilaamaan varovasti kanavan seinämiä. Ensimmäinen mikrobiologinen näyte (S1) otettiin juurikanavasta steriileillä paperipisteillä, jotka asetettiin peräkkäin WL: hen. Kolme steriiliä paperipistettä asetettiin juurikanavaan näytteenottoa varten. Jokainen paperipiste jätettiin kanavaan noin 1 minuutiksi. Sekä paperipisteet että endodonttinen käsiinstrumentti ilman kahvaa siirrettiin kryoputkiin, jotka sisälsivät 300 μl PBS-liuosta, joita säilytettiin -20 °C:ssa. Näytteet siirrettiin geneettisen analyysin laboratorioon jatkoanalyysiä varten kylmäketjussa.

Juurikanavat valmistettiin käyttämällä Revo S -viiloja ja kasteltiin 2,5 % NaOCl:lla. Kanavat suurennettiin apikaalisesti kokoon 35 (AS35) työpituudella. Jokaisen instrumentin vaihdon välillä juurikanavaa kasteltiin 5 ml:lla 2,5-prosenttista NaOCl-liuosta käyttämällä 30 gaugen sivutuuletettua neulaa, joka sijoitettiin 1-2 mm työpituuden alapuolelle. Tästä syystä huuhteluliuosta käytettiin yhteensä 30 ml. Kun instrumentointi oli suoritettu, sivelykerros poistettiin 2 ml:lla 17-prosenttista EDTA:ta, joka jätettiin kanavaan 3 minuutiksi, mitä seurasi 2,5-prosenttinen NaOCl. Juurikanava kuivattiin steriileillä paperikärkillä ja huuhdeltiin 2 ml:lla 10-prosenttista natriumtiosulfaattia 1 minuutin ajan NaOCl-liuoksen inaktivoimiseksi. Seuraavaksi näyte (S2) otettiin kanavista kuten on kuvattu S1:lle. Tämän jälkeen NaOCl:a sekoitettiin/aktivoitiin alla kuvatulla tavalla.

XPF-ryhmä: Instrumentti XP-Endo-viimeistelylaite (FKG Dentaire, koko #25, kartiomainen .00) jäähdytettiin (Endo-Frost; Roeko, Langenau, Saksa), jotta se pysyisi suorana ja mittaa WL. Kanavia huuhdeltiin 2,5 ml:lla 2,5 % NaOCl:a 30 sekunnin ajan ja aktivoitiin XPF-instrumentilla, joka asetettiin kanavaan 1 mm:n etäisyydelle WL:stä ja sai virtaa moottorista nopeudella 800 rpm (1 N-cm vääntömomentti) 30 sekunnin ajan. valmistajan ohjeiden mukaan (hitaissa ylös-alas-liikkeissä noin 7 mm:n amplitudilla jatkuvassa kierrossa). Sitten kanavat huuhdeltiin 2,5 ml:lla 2,5-prosenttista NaOCl:a, mitä seurasi aineen aktivointi XPF-instrumentilla 30 sekunnin ajan samalla tavalla kuin edellä. Jokaiselle kanavalle käytettiin uutta XP-endo Finisher -tiedostoa.

EA-ryhmä: Juurikanavia kasteltiin 2,5 ml:lla 2,5-prosenttista NaOCl:a 30 sekunnin ajan, minkä jälkeen tämän liuoksen ääniaktivointi EndoActivatorin punaisella kärjellä nro 25/0,04 (EA; Dentsply Tulsa Dental Specialties, Tulsa, OK), asetettu juurikanavaan 1 mm:n päässä WL:stä, nopeudella 10 000 cpm/min. 30 sekunnin ajan. EA-polymeerikärki liikkui pystysuunnassa kanavan apikaalisesta osasta koronaaliseen osaan aktivoinnin aikana. Sitten sama toimenpide toistettiin vielä kerran (2,5 ml:n 2,5 % NaOCl:n ääniaktivointi 30 sekuntia) niin, että NaOCl:lla suoritetun huuhtelun kokonaisaika ja testilaitteiden huuhtelusekoitusaika oli 1 min. NaOCl:n kokonaistilavuus kanavaa kohti molemmissa ryhmissä oli 35 ml. Molemmissa ryhmissä käytettiin 5 ml NaOCl:a ja aktivoitiin yhden minuutin ajan.

Lopuksi molempien ryhmien kanavat kuivattiin ja huuhdeltiin 2 ml:lla 10-prosenttista natriumtiosulfaattia 1 minuutin ajan. Aktivaation jälkeinen näyte (S3) saatiin samalla tavalla kuin esiaktivointinäyte kerättiin ja lähetettiin PCR-analyysiä varten. Juurikanavahoito eteni juuritäytteellä guttaperkan lateraalisella kondensaatiolla. Pääsyontelot palautettiin komposiittihartsilla ja otettiin lopullinen röntgenkuva. Kaikki juurikanava- ja mikrobinäytteenottotoimenpiteet suoritti yksi kokenut endodontti. Bakteerien kokonaismäärät sekä Enterococcus faecalisin määrä määritettiin ennen instrumentointia, instrumentoinnin ja kasteluaktivointijärjestelmien käytön jälkeen pisaradigitaalipolymeraasiketjureaktion (ddPCR) avulla.

Bakteerien kokonaismäärä sekä Enterococcus faecalis -bakteerin määrä määritettiin ennen instrumentointia, instrumentoinnin ja kanavansisäisten lääkkeiden käytön jälkeen ddPCR:n avulla.

Genomisen DNA:n eristäminen ja DNA-pitoisuuden mittaus DNA uutettiin käyttämällä QIAamp DNA Mini Kit -sarjaa (Qiagen, Saksa) noudattaen valmistajan suosittelemaa protokollaa. Ennen DNA:n eristämistä näytteet (paperikärkiset putket) digestoitiin 50-60 °C:ssa vorteksoimalla 30 sekunnin ajan 10 minuutin välein kaikkien bakteerien hajoamisen varmistamiseksi PBS-liuokseen. Sen jälkeen paperipisteet poistettiin aseptisesti suspensiosta ja bakteerisuspensio pelletoitiin sentrifugoimalla 10 minuuttia 5000 g:ssä. Pelletti suspendoitiin sitten uudelleen 180 ul:aan puskuri-ATL-puskuria, jonka toimitti QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Saksa) ja lisättiin 20 ui proteinaasi K:ta (20 mg/ml). Näytteitä inkuboitiin 3 tuntia 56 °C:ssa. Tämän jälkeen bakteerien genominen kokonais-DNA eristettiin QIAamp DNA Mini Kitin protokollan mukaisesti. Kunkin näytteen DNA-liuoksen lopullinen tilavuus oli 150 µl ja se otettiin huomioon laskennassa. DNA-pitoisuus (absorbanssi 260 nm:ssä) määritettiin spektrofotometrillä (Promega Quantifluor).

16S-rRNA-geenien monistus Tässä tutkimuksessa suunniteltiin alukkeita Universal- ja Enterococcus 16S-rRNA-geeneille. Näytteiden DNA-uuton jälkeen QIAamp DNA Mini Kit -pakkauksella 700-800 bp 16S-rRNA-sekvenssejä monistettiin käyttämällä universaalia E8F-forward-aluketta (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') ja universaalia E1115R-käänteisaluketta (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3') 59. PCR-reaktioiden lopullinen tilavuus kullekin eristetylle bakteerikannalle säädettiin 25 ul:ksi. 16S-rRNA-geenien monistusreaktiot suoritettiin seuraavissa olosuhteissa. 1 esidenaturointijakso 95 °C:ssa 3 minuuttia, 35 sykliä 95 °C:ssa 30 sekuntia, 55 °C:ssa 30 sekuntia ja 72 °C:ssa 30 sekuntia, jotka jatkuvat viimeisellä pidennysvaiheella 72 °C:ssa 10 minuuttia .

PCR-tuotteet analysoitiin elektroforeesilla käyttäen 2-prosenttista agaroosigeeliä (sisältää etidiumbromidia) Tris/BoratE/EDTA (TBE) -puskurissa, ja geelit analysoitiin ultraviolettivalossa (140 V:ssa 20 minuuttia). Heidän kuvat visualisoitiin ultraviolettivalossa. Lisäksi ddPCR:ssä käytettävien alukkeiden ohjaus ja optimointi tehtiin myös tavanomaisessa PCR:ssä.

16S-rRNA-geenin puhdistus ja sekvensointi PCR-reaktioiden jälkeen PCR-tuotteiden puhdistus suoritetaan hydrolysoimalla ylimääräiset alukkeet ja nukleotidit ExoSap-IT:llä (Thermo, PN: 78201.1.ML), joka sisältää eksonukleaasi I- ja alkalifosfataasientsyymejä. 2 ui ExoSap-IT:tä sekoitettiin 5 ul:aan PCR-tuotetta jokaista näytettä kohti. ExoSap-reaktio suoritetaan 37 °C:ssa 15 minuutin ajan (entsyymiaktivaatio), jota seuraa 15 minuuttia (inaktivointi) 80 °C:ssa. Sekvensointireaktiot suoritettiin käyttämällä Bigdye™ Terminator v3.1 -syklin sekvensointisarjaa (Thermo). Reaktiot suoritettiin pakkauksen käsikirjan mukaisesti kaikille eristetyille kannoille.

Kun tuotteet oli puhdistettu Exosapilla, sekvenssireaktio suoritettiin BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit -sarjalla (Thermo) seuraavissa olosuhteissa. Sekvenssi-PCR:n jälkeen BigDye-tuotteet puhdistettiin paksusuolen menetelmällä. Tähän prosessiin käytettiin Zymo ZR DNA Sequencing Clean-up Kit (Zymo Research, USA). Kaikki näytteet puhdistettiin pakkauksessa annetun protokollan mukaisesti ja suoritettiin geneettisellä 3130XL-analysaattorilla.

Droplet Digital PCR (ddPCR) Droplet Digital PCR (ddPCR) suoritettiin käyttämällä alukkeita, jotka oli suunniteltu 16S-rRNA-alueen mukaan, joka on spesifinen kokonaisbakteeri- ja Enterococcus faecalis -lajeille, sekvensoinnin jälkeen absoluuttisen kvantifioinnin jälkeen paperipistenäytteestä löydetyistä bakteerilajeista. Alukeparit olivat 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' ja 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 bakteerien kokonaismäärälle ja ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' ja ENT-R-5'-GCCATATGCGG -3' alukeparit Enterococcus Faecalisille. PCR-reaktiossa amplikonit, jotka oli monistettu merkitsemättömillä alukepareilla, analysoitiin leimaamalla Eva-Green-väriaineella. Enterococcuksen ja kokonais-16S rRNA:n absoluuttista kvantitointia varten suoritettiin PCR kahdella alukeparilla samasta näytteestä. 20 µl PCR-seosta, joka sisältää 10 µl 2X ddPCR EvaGreen Supermixiä (Bio-Rad, kat. ei. 1864034), 9 µl nukleaasivapaata vettä, 0,25 µl sekä forward- että reverse-aluketta ja 2 ng DNA:ta kustakin näytteestä Lämpösykliolosuhteet olivat: 95 ◦ C 5 min, sitten 40 sykliä 95 ◦ C 30 s ja 60 ◦ C 1 minuutin ajan ja kaksi viimeistä vaihetta 4 ◦ C 5 minuutin ajan ja 90 ◦ C 5 minuutin ajan 4 ◦ C äärettömällä pitolla. Kun PCR oli valmis, sinetöity levy siirrettiin QX200 Droplet Readerin (Bio-Rad, kat.) levytelineeseen. ei. 1864003).