Количественная оценка эффективности двух систем активации ирригации

Критерии приемлемости Исследуемая популяция состояла из 20 пациентов (9 женщин и 11 мужчин в возрасте 19-66 лет), обратившихся в эндодонтическую клинику Стоматологической школы Стамбульского университета Медиполь для нехирургического эндодонтического перелечивания зубов с поражениями апикального периодонтита. В это исследование были включены 20 ранее пролеченных корневых каналов зубов с клиническими и рентгенологическими признаками хронического поражения апикального периодонтита. Рентгенологически диаметр периапикального просвета колебался от 2 до 7 мм. Зубы с апикальным периодонтитом после лечения прошли эндодонтическое лечение более 2 лет назад и потребовали повторного лечения. Окончания пломбирования корневых каналов находились на расстоянии 0-4 мм от рентгенологической верхушки, без переполнения. Зубы имели интактные коронковые реставрации без явного воздействия корневого пломбировочного материала на полость рта. Выбранные зубы имели достаточную структуру коронки для адекватной изоляции коффердамом, отсутствие пародонтальных карманов или уровень прикрепления глубже 4 мм. Также применялись следующие критерии исключения: зубы пациентов, получавших антибиотики в течение предшествующих 3 месяцев или имевших какое-либо общее заболевание, зубы, которые не удалось должным образом изолировать раббердамом, зубы с отсутствием коронарной герметизации, зубы с пародонтальным карманом глубина >4 мм; и зубы с переломом коронки/корня. От каждого пациента был включен только один зуб.

Процедуры лечения корневых каналов и взятие проб коффердама и асептическая техника использовались на протяжении всего повторного эндодонтического лечения. После удаления зубного налета и изоляции раббердамом операционное поле очищали 3% перекисью водорода и дезинфицировали 2,5% раствором NaOCl. Затем все коронковые реставрации, штифты и кариозные дефекты были удалены, а подготовка доступа завершена, когда пломба корневого канала была должным образом обнажена. После этого зуб (включая пульповую камеру), зажим и прилегающий коффердам еще раз продезинфицировали 2,5% раствором NaOCl с последующей инактивацией 10% раствором тиосульфата натрия, чтобы избежать помех при бактериологическом отборе проб. Образцы для контроля стерильности (SR1) были взяты с поверхности зуба стерильным тампоном Omni Swab (Whatman FTA, Sigma-Aldrich) со съемной головкой. Бумажные штифты переносили в криопробирки, содержащие раствор фосфатно-солевого буфера (PBS), хранящиеся при -20°C. В каждом случае брали пробу из одного корневого канала, чтобы ограничить микробную оценку одной экологической средой. В многокорневых зубах выбирали корень с периапикальным поражением. Если во всех корнях были периапикальные поражения, выбирался более широкий канал. Два из каналов, включенных в это исследование, были из однокорневых зубов, 3 были щечными каналами в премолярах верхней челюсти, 1 небный канал в молярах верхней челюсти и 10 дистальных каналов в молярах нижней челюсти.

Старые корневые пломбы были удалены с помощью бормашин Gates-Glidden (Dentsply Maillefer, Ballaigues, Швейцария) и эндодонтических файлов без использования химических растворителей. Рабочая длина (РД) была установлена ​​на 1 мм меньше апикального отверстия с помощью апекслокатора (Raypex6; VDW GmbH, Мюнхен, Германия), а затем были сделаны периапикальные рентгенограммы, чтобы убедиться, что весь пломбировочный материал удален. Промывание стерильным физиологическим раствором было выполнено для удаления любых оставшихся материалов и увлажнения канала перед сбором образца. Затем канал оставили заполненным физиологическим раствором, а небольшой ручной инструмент поместили в СС и использовали для аккуратной обработки стенок канала. Исходный микробиологический образец (S1) был взят из корневого канала с помощью стерильных бумажных штифтов, последовательно помещенных в WL. Для взятия проб в корневой канал вставляли три стерильных бумажных штифта. Каждую бумажную штифт оставляли в канале примерно на 1 минуту. Как бумажные штифты, так и эндодонтический ручной инструмент без ручки переносили в криопробирки, содержащие 300 мкл раствора PBS, хранящиеся при -20°C. Образцы были переданы в лабораторию генетического анализа для дальнейшего анализа в холодовой цепи.

Корневые каналы препарировали файлами Revo S и промывали 2,5% раствором NaOCl. Каналы были апикально расширены до размера 35 (AS35) на рабочей длине. Между каждой сменой инструмента корневой канал промывали 5 мл 2,5% раствора NaOCl с помощью иглы 30G с боковым отверстием, которая вставлялась на 1-2 мм меньше рабочей длины. Таким образом, всего было использовано 30 мл ирригационного раствора. После завершения инструментальной обработки смазанный слой удаляли 2 мл 17% ЭДТА, который оставляли в канале на 3 минуты, а затем 2,5% NaOCl. Корневой канал высушивали стерильными бумажными штифтами и промывали 2 мл 10% тиосульфата натрия в течение 1 мин для инактивации раствора NaOCl. Затем из каналов был взят образец (S2), как описано для S1. После этого NaOCl перемешивали/активировали, как описано ниже.

Группа XPF: Инструмент XP-Endo Finisher (FKG Dentaire, размер №25, конусность .00) был охлажден (Endo-Frost; Roeko, Лангенау, Германия), чтобы держать его прямым и измерять WL. Каналы были промыты 2,5 мл 2,5% NaOCl в течение 30 с и активированы с помощью инструмента XPF, который был помещен в канал на 1 мм ниже WL и приводился в действие двигателем со скоростью 800 об/мин (крутящий момент 1 Н·см) в течение 30 с. в соответствии с инструкциями производителя (медленными движениями вверх-вниз с амплитудой примерно 7 мм при непрерывном вращении). Затем каналы промывали 2,5 мл 2,5% NaOCl с последующей активацией вещества прибором XPF в течение 30 секунд, как описано выше. Для каждого канала использовался новый файл XP-endo Finisher.

Группа EA: корневые каналы промывались 2,5 мл 2,5% NaOCl в течение 30 с с последующей звуковой активацией этого раствора с помощью красного наконечника EndoActivator № 25/0,04. (EA; Dentsply Tulsa Dental Specialties, Талса, Оклахома), вставленный в корневой канал на 1 мм ниже WL, со скоростью 10 000 имп/мин. в течение 30 секунд. Наконечник из полимера ЭА перемещался вертикально от апикальной к коронковой части канала во время активации. Затем ту же процедуру повторяли еще раз (звуковая активация 2,5 мл 2,5% NaOCl в течение 30 секунд) так, чтобы общее время орошения NaOCl и время ирригационного перемешивания с тестовыми устройствами составило 1 мин. Общий объем NaOCl, использованный на канал в обеих группах, составил 35 мл. В обеих группах использовали 5 мл NaOCl и активировали в течение одной минуты.

Наконец, каналы в обеих группах были высушены и промыты 2 мл 10% тиосульфата натрия в течение 1 мин. Образец после активации (S3) был получен таким же образом, как образец перед активацией был собран и отправлен на ПЦР-анализ. Завершение лечения корневого канала продолжилось пломбированием корня с использованием латеральной конденсации гуттаперчи. Полости доступа были восстановлены композитной смолой, и была сделана окончательная рентгенограмма. Все процедуры взятия проб корневых каналов и микробов выполнялись одним опытным эндодонтистом. Общую бактериальную нагрузку, а также количество Enterococcus faecalis определяли до инструментальной обработки, после инструментальной обработки и использования систем активации орошения с помощью капельной цифровой полимеразной цепной реакции (ддПЦР).

Общую бактериальную нагрузку, а также количество Enterococcus faecalis определяли до инструментальной обработки, после инструментальной обработки и применения внутриканальных препаратов с помощью ddPCR.

Выделение геномной ДНК и измерение концентрации ДНК ДНК выделяли с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Перед выделением ДНК образцы (пробирки с бумажными наконечниками) переваривали при 50-60°С Встряхиванием в течение 30 с через каждые 10 мин для обеспечения дезагрегации всех бактерий в раствор PBS. После этого бумажные штифты асептически удаляли из суспензии и бактериальную суспензию осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 5000 g. Затем осадок ресуспендировали в 180 мкл буфера ATL, поставляемого QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany), и добавляли 20 мкл протеиназы K (20 мг/мл). Образцы инкубировали в течение 3 ч при 56°С. Затем была выделена общая бактериальная геномная ДНК в соответствии с протоколом QIAamp DNA Mini Kit. Конечный объем раствора ДНК каждого образца составлял 150 мкл и учитывался при расчете. Концентрацию ДНК (оптическую плотность при 260 нм) определяли на спектрофотометре (Promega Quantifluor).

Амплификация генов 16S рРНК В данном исследовании были созданы праймеры для генов 16S рРНК Universal и Enterococcus. После выделения ДНК из образцов с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit последовательности 16S рРНК длиной 700–800 п.н. были амплифицированы с использованием универсального прямого праймера E8F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и универсального обратного праймера E1115R (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3'). 59. Конечный объем реакции ПЦР для каждого выделенного бактериального штамма доводили до 25 мкл. Реакции амплификации генов 16S рРНК проводили при следующих условиях. 1 цикл преденатурации при 95°С в течение 3 минут, 35 циклов при 95°С в течение 30 секунд, 55°С в течение 30 секунд и 72°С в течение 30 секунд, которые продолжаются заключительной стадией удлинения при 72°С в течение 10 минут. .

Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза с использованием 2% агарозного геля (содержащего бромистый этидий) в буфере Tris/BoratE/EDTA (TBE) с анализом гелей в ультрафиолетовом свете (при 140 В в течение 20 минут). Их изображения визуализировали при ультрафиолетовом освещении. Кроме того, контроль и оптимизация праймеров, которые будут использоваться для ddPCR, также выполнялись в традиционной PCR.

Очистка и секвенирование гена 16S рРНК После реакций ПЦР очистку продуктов ПЦР проводят путем гидролиза избытка праймеров и нуклеотидов с помощью ExoSap-IT (Thermo, PN: 78201.1.ML), содержащего экзонуклеазу I и ферменты щелочной фосфатазы. 2 мкл ExoSap-IT смешивали с 5 мкл продукта ПЦР для каждого образца. Реакцию ExoSap проводят при 37 °C в течение 15 минут (активация фермента), а затем 15 минут (инактивация) при 80 °C. Реакции секвенирования проводили с использованием набора для циклического секвенирования Bigdye™ Terminator v3.1 (Thermo). Реакции проводили согласно инструкции к набору для всех выделенных штаммов.

После очистки продуктов с помощью Exosap реакцию секвенирования проводили с помощью набора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo) при следующих условиях. После ПЦР секвенирования продукты BigDye очищали методом толстой кишки. Для этого использовали набор Zymo ZR DNA Sequencing Clean-up Kit (Zymo Research, США). Все образцы были очищены в соответствии с протоколом, приведенным в наборе и выполненным на генетическом анализаторе 3130XL.

Капельная цифровая ПЦР (ddPCR) Капельная цифровая ПЦР (ddPCR) проводилась с использованием праймеров, разработанных в соответствии с участком 16S рРНК, специфичным для всех бактерий и видов Enterococcus faecalis, после секвенирования и абсолютного количественного определения видов бактерий, обнаруженных в образце бумажных игл. Пары праймеров: 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' и 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 для всех бактерий и ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' и ENT-R-5'-GCCATGCGGCATAAACTG. -3' пары праймеров для Enterococcus Faecalis. В реакции ПЦР ампликоны, амплифицированные с немаркированными парами праймеров, анализировали путем мечения красителем Eva-Green. Для абсолютного количественного определения Enterococcus и общей 16S рРНК проводили ПЦР с двумя парами праймеров из одного и того же образца. 20 мкл смеси для ПЦР, содержащей 10 мкл 2X ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad, кат. нет. 1864034), 9 мкл воды без нуклеаз, по 0,25 мкл прямого и обратного праймера и 2 нг ДНК из каждого образца. 60°C в течение 1 мин и два заключительных шага при 4°C в течение 5 минут и 90°C в течение 5 минут с бесконечной выдержкой 4°C. После завершения ПЦР запечатанный планшет переносили в держатель планшета устройства для считывания капель QX200 (Bio-Rad, кат. нет. 1864003).