Cigaretový kouř nazální a plná krev u pacientů s chronickou obstrukční plicní nemocí (CHOPN)

Úvod Chronická obstrukční plicní nemoc (CHOPN) je běžné respirační onemocnění, které způsobuje rozšířenou morbiditu a mortalitu. Studie Global Burden of Disease odhaduje CHOPN jako v současnosti šestou nejčastější příčinu úmrtí na celém světě. Desetiletí kouření cigaret je zdaleka hlavním přispívajícím faktorem, což způsobuje řadu respiračních poruch; včetně chronické bronchitidy, obstrukční bronchiolitidy, emfyzému a plicního vaskulárního onemocnění. Medikamentózní léčba CHOPN je převážně paliativní; zahrnující odvykání kouření, použití inhalačních bronchodilatancií a dlouhodobou oxygenoterapii respiračního selhání. Nedávno bylo zjištěno, že u kuřáků, u kterých se rozvine CHOPN, dochází ve srovnání se „zdravými kuřáky“ k zesílení zánětu a že je naléhavě potřeba vyvinout nové modely problémů, které by zhodnotily, proč se CHOPN u některých silných kuřáků vyvíjí.

Cigarette Smoke Nosal Challenge Model Nos je přístupná část dýchacího systému, ze které je možné získat tkáňové exsudáty a buněčné kartáčky neinvazivním způsobem. Nedávno byl publikován komplexní přehled rozsáhlých zkušeností z klinického výzkumu s těmito nazálními metodikami. Existuje také názor, že pacienti s CHOPN mají běžně záněty dýchacích cest i nosních cest s podobným typem zánětlivého infiltrátu v dolních a horních cestách dýchacích. U CHOPN zánět zahrnuje převážně neutrofily a makrofágy, na rozdíl od nárůstu žírných buněk a eozinofilů charakteristických pro astma.

Již dlouho se uznává, že existuje silný funkční a imunologický vztah mezi nosem a průduškami, zejména pokud jde o infiltraci leukocytů a zánětlivých mediátorů při srovnání alergické rýmy a alergického astmatu. Horní a dolní cesty dýchací mají související respirační epitel a podobné reakce na výzvu alergenu.

Bylo prokázáno, že nosní a bronchiální sliznice kuřáků s CHOPN jsou infiltrovány CD8+ T lymfocyty a neutrofily. To odpovídá přítomnosti nosních symptomů během exacerbací CHOPN a hladiny IL-8 ve sputu a nosu jsou u CHOPN korelovány.

Za účelem odběru vzorků nosních exsudátů pro alergické zánětlivé mediátory jsou klasickými metodami nosní laváže metody popsané Naclerio et al., metoda nazálního bazénu Greiffem et al. a použití Foleyova katétru Grünbergem a kolegy. Výplach se provádí fyziologickým roztokem v objemech mezi 1 a 10 ml. Byla porovnána opakovatelnost a validita různých metod nosní laváže.

Tommy Sim a kolegové vyvinuli použití proužků filtračního papíru, které se umísťují na turbináty, aby absorbovaly nosní sekrety. Metoda nosního filtračního papíru má výhodu přímého odběru nosních sekretů, které jsou méně zředěné, a proto mohou zachytit proteinové signály, které jsou pod detekčními limity nosní laváže. K měření chemokinů a cytokinů po NAC byla použita metoda matrice nebo filtračního papíru.

Vzorky buněk lze získat z nosní sliznice pomocí malých nylonových kartáčků na zubní nit, které se jemně otáčejí nad epitelem, a poté se připojené buňky uvolní ve vyváženém solném roztoku. Bylo prokázáno, že čištění nosu lze použít jako alternativu k nazální biopsii [24], zatímco supernatanty z nosního kartáčku lze analyzovat na uvolňování cytokinů [25]. Alternativní metodou je použití seškrabu z nosní sliznice pomocí plastové kyrety (Rhinoprobe, Arlington Scientific, Utah). Čištění nosu a škrábání způsobuje určité nepohodlí, ale nevyžaduje lokální anestezii. Nosní biopsie je obecně prováděna odborníkem ze spodního okraje dolní skořepiny. Jedná se o traumatický výkon, který vyžaduje pečlivou lokální anestezii, ale získá se vzorek slizničního epitelu s bazální membránou a submukózní tkání.

Nasal allergen challenge (NAC) je prokázaným přínosem pro testování nové protizánětlivé léčby alergické rýmy a astmatu.

NAC má výhody oproti inhalačnímu alergenu, protože je snadnější získat subjekty, je méně invazivní a lze snadno získat opakované vzorky tkáně. Malému počtu pacientů mohou být podány i jednotlivé dávky terapie a byly zaznamenány protizánětlivé a klinické účinky na odpovědi NAC. Použitím těchto provokačních metod ve fázi II vývoje léku na astma a alergickou rinitidu je možné poskytnout včasné a spolehlivé rozhodnutí „Go/No Go“ před zahájením rozsáhlých, dlouhodobých a nákladných studií fáze III.

Doufáme, že vyvineme analogický provokační model pro CHOPN na základě hodnocení účinků nazální provokace cigaretovým kouřem.

Hlavním úkolem je vyvinout návrhy klinické farmakologie fáze IIa, které lze použít k hodnocení protizánětlivých léků vyvíjených pro CHOPN. Nosní epiteliální a zánětlivé reakce na expozici ozónu byly hodně studovány [31–39]. COPD je skutečně charakterizováno chronickým zánětem s nerovnováhou v hladinách oxidantu/antioxidantu a systémový zánět může vyvolat lokální námahou vyvolaný oxidační stres.

Tříleté klinické studie zahrnující tisíce pacientů zjistily, že inhalační kortikosteroidy neovlivňují zrychlenou ztrátu plicních funkcí u CHOPN. Kromě toho probíhající studie fáze III s perorálními inhibitory fosfodiesterázy typu 4 (PDE4) jsou také nepřesvědčivé, přestože počáteční menší studie vypadaly slibně. Zjevně existuje naléhavá potřeba vyvinout neinvazivní biomarkery a modely klinických testů pro použití ve fázi II klinických farmakologických studií, aby bylo možné spolehlivě posoudit účinky protizánětlivé léčby CHOPN.

Použití modelů nazální provokace ve spojení s citlivými biomarkery a klinickými cíli by snad mohlo být použito ke stanovení klinické účinnosti nových léků na CHOPN ve studiích malého rozsahu. Nové terapie mají potenciál selektivně inhibovat různé typy buněk a konkrétní mediátory zapojené do různých zánětlivých onemocnění. Domníváme se, že nazální alergenová provokace má výhody oproti inhalační provokaci: bezpečnost, opakované neinvazivní odběry vzorků.

V budoucnu to zajistí, že nazální provokace bude hrát rostoucí roli v klinickém farmakologickém hodnocení protizánětlivé léčby. Pokračuje velké úsilí ve vývoji modelů nosní provokace k napodobení zánětu zjištěného u CHOPN, které lze použít při klinickém farmakologickém hodnocení nových protizánětlivých léků.

Výzva plné krve in vitro s cigaretovým kouřem Vzorky krve budeme stimulovat v laboratoři způsobem in vitro pomocí extraktu z cigaretového kouře. Extrakt z cigaretového kouře se vyrábí v digestoři zajišťující bezpečnost laboratorního personálu. Cigaretový kouř obsahuje mnoho toxických sloučenin včetně volných radikálů a oxidantů. Cigarette smoke conditioning medium (CSCM) se vyrábí probubláváním kouře z hořících cigaret pufrovaným solným roztokem a toho lze použít ke stimulaci buněk in vitro. Bylo prokázáno, že extrakt z cigaretového kouře je cytotoxický pro alveolární buněčnou linii typu II a tento účinek může být blokován N-acetylcysteinem, lapačem oxidantů. {Hoshino, Mio a kol. 2001 7463 /id}. Vyvinuli jsme metody hodnocení upregulace neutrofilů CD11b v reakci na stimulaci cytokiny a chemokiny. CD11b je buněčný povrchový receptor na leukocytech, který je mobilizován z intracelulárních zásob, když jsou buňky stimulovány. Povrchový CD11b lze měřit pomocí fluorescenčně značených protilátek a průtokové cytometrie. Vyvinuli jsme metodu stimulace plné krve pomocí CSCM, která po inkubaci po dobu 20 minut produkuje 200% zvýšení upregulace CD11b. Tento účinek se dále zvyšuje, pokud je před stimulací z celé krve odstraněna plazma, a účinek může být částečně inhibován přítomností redukovaného glutathionu. U pacientů s CHOPN a kuřáků bylo prokázáno, že mají sníženou antioxidační kapacitu v jejich plazmě. Naším cílem je porovnat odpovědi neutrofilů na stimulaci CSCM v plné krvi a promyté krvi, kde byla odstraněna plazma, abychom porovnali citlivost neutrofilů mezi pacienty s CHOPN a kuřáky a možné antioxidační účinky plazmy.

Přehled plánovaného výzkumu

Do této studie budou zařazeny dvě charakterizované shodné skupiny kuřáků s CHOPN a „zdraví“ kuřáci, kteří nemají plicní onemocnění. Každá skupina bude mít 8 předmětů. Každý subjekt bude muset absolvovat 2 návštěvy na oddělení klinických studií NHLI takto:

Návštěva 1: Screening Během screeningu budou kandidáti studie plně informováni o povaze studie a možných AE. Kandidáti si musí přečíst formulář souhlasu a podepsat dokument poté, co vyšetřovatel zodpoví všechny otázky ke spokojenosti kandidáta. Další postupy mohou začít až po podepsání formuláře souhlasu. Subjekt podepíše dva originály formuláře informovaného souhlasu. Originál podepsaného formuláře souhlasu si ponechá vyšetřovatel a druhý originál dostane kandidát, který si vezme domů.

Uchazeči budou hodnoceni pro vstup do studie podle uvedených kritérií pro zařazení a vyloučení. Pro zjištění celkového zdravotního stavu a kvalifikace každého kandidáta pro zápis do studie budou provedeny následující postupy:

• Získejte podepsaný, písemný informovaný souhlas
• Zaznamenejte si anamnézu léků za posledních 30 dní Zaznamenejte si anamnézu, včetně stavu kouření
• Proveďte fyzikální vyšetření srdce, plic a nosu
• Těhotenský test pro ženy v plodném věku
• Proveďte spirometrii a otestujte reverzibilitu
• Zkontrolujte kritéria pro zařazení a vyloučení

Zkoušející vyhodnotí výsledky všech vyšetření včetně klinických laboratorních testů a určí vhodnost každého kandidáta pro studii. Když je subjekt vhodný pro studii, odebere se vzorek krve (10 ml) pro expozici celé krvi cigaretovým kouřem.

Návštěva 2: Nazální kouření Každý subjekt bude mít dovoleno vykouřit alespoň 5 cigaret mezi 9:00 a 21:00 den před návštěvou jednotky a v předchozích 7 dnech. V den studie bude každý pacient požádán, aby kouřil jednu cigaretu, ale vydechoval nosem.

Po této cigaretové výzvě provedeme následující procedury po dobu 8 hodin (před(x2), 1h, 2h, 3h, 4h, 6h a 8h):

1. Výplach nosu spočívá v omytí nosu 5 ml (čajová lžička) teplého solného roztoku. Tento roztok se opatrně vede z injekční stříkačky přes dutou "olivu" do konce levé nosní dírky. Tekutina nevstupuje do dutin ani neprochází zadní částí nosu. V každém časovém bodě budou provedena celkem 2 spláchnutí.
2. Nosní filtrační papír se skládá z proužků papíru o rozměrech 7 mm x 30 mm, které jsou jemně umístěny na konec pravé nosní dírky. Nechají se tam až 2 minuty, dokud nejsou zvlhčené nosním sekretem.
3. Bude vložena kanyla, která umožní odběr krve ve výše uvedených časových bodech pro analýzu cytokinů a chemokinů v séru.
4. Těhotenský test pouze pro ženy v plodném věku.

V rámci studie budou subjekty informovány o škodlivých účincích kouření cigaret a upozorněni na nutnost přestat kouřit. Subjektům budou nabídnuty kurzy kouření, které jim pomohou přestat kouřit. Předpokládá se, že den studia bude stanoven jako datum ukončení pro předměty.