Test prowokacyjny z dymem papierosowym i krwią pełną u pacjentów z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc (POChP)

Wprowadzenie Przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) jest powszechną chorobą układu oddechowego, która powoduje powszechną chorobowość i śmiertelność. Badanie Global Burden of Disease Study szacuje, że POChP jest obecnie szóstą najczęstszą przyczyną zgonów na świecie. Dziesięciolecia palenia papierosów są zdecydowanie głównym czynnikiem przyczyniającym się do tego, co powoduje szereg zaburzeń układu oddechowego; w tym przewlekłe zapalenie oskrzeli, obturacyjne zapalenie oskrzelików, rozedma płuc i choroba naczyń płucnych. Leczenie farmakologiczne POChP jest w dużej mierze paliatywne; obejmujące zaprzestanie palenia, stosowanie wziewnych leków rozszerzających oskrzela i długotrwałą tlenoterapię w przypadku niewydolności oddechowej. Ostatnio uznano, że u palaczy, u których rozwinęła się POChP, występuje nasilenie stanu zapalnego w porównaniu ze „zdrowymi palaczami” i że istnieje pilna potrzeba opracowania nowych modeli prowokacji, aby ocenić, dlaczego POChP rozwija się u niektórych nałogowych palaczy.

Model Prowokacji Nosowej Dymem Papierosowym Nos jest dostępną częścią układu oddechowego, z której w sposób nieinwazyjny można pobrać wysięki tkankowe i wypustki komórkowe. Niedawno opublikowano obszerny przegląd obszernych badań klinicznych z tymi metodologiami nosa. Istnieje również pogląd, że pacjenci z POChP często mają zapalenie zarówno dróg oddechowych, jak i przewodów nosowych, z podobnym typem nacieku zapalnego w dolnych i górnych drogach oddechowych. W POChP zapalenie obejmuje głównie neutrofile i makrofagi, w przeciwieństwie do charakterystycznego dla astmy wzrostu komórek tucznych i eozynofili.

Od dawna wiadomo, że istnieje silny związek czynnościowy i immunologiczny między nosem a oskrzelami, zwłaszcza pod względem naciekających leukocytów i mediatorów stanu zapalnego, porównując alergiczny nieżyt nosa i astmę alergiczną. Górne i dolne drogi oddechowe mają pokrewny nabłonek oddechowy i podobne odpowiedzi na prowokację alergenem.

Wykazano, że błona śluzowa nosa i oskrzeli u palaczy z POChP jest naciekana przez limfocyty T CD8+ i neutrofile. Odpowiada to występowaniu objawów nosowych podczas zaostrzeń POChP, a poziomy IL-8 w plwocinie iw nosie są skorelowane w POChP.

W celu pobrania próbek wysięku z nosa na obecność alergicznych mediatorów zapalnych, klasyczne metody płukania nosa to te opisane przez Naclerio i wsp., metoda basenu nosowego Greiffa i wsp. oraz użycie cewnika Foleya przez Grünberga i współpracowników. Płukanie wykonuje się solą fizjologiczną w objętości od 1 do 10 ml. Porównano powtarzalność i trafność różnych metod płukania nosa.

Tommy Sim i współpracownicy opracowali zastosowanie pasków bibuły filtracyjnej, które są umieszczane na małżowinach nosowych w celu wchłaniania wydzielin z nosa. Metoda bibuły filtracyjnej do nosa ma tę zaletę, że bezpośrednio pobiera wydzielinę z nosa, która jest mniej rozcieńczona i dlatego może wychwycić sygnały białkowe, które są poniżej granic wykrywalności płukania nosa. Do pomiaru chemokin i cytokin po NAC zastosowano metodę matrycową lub bibułę filtracyjną.

Próbki komórek można pobrać z błony śluzowej nosa za pomocą małych nylonowych szczoteczek do nitkowania zębów, które delikatnie obraca się po nabłonku, a następnie przyczepione komórki usuwa się w zrównoważonym roztworze soli. Wykazano, że szczotkowanie nosa może być stosowane jako alternatywa dla biopsji nosa [24], podczas gdy supernatanty wymazu ze szczoteczki do nosa można analizować pod kątem uwalniania cytokin [25]. Alternatywną metodą jest pobranie zeskrobin z błony śluzowej nosa za pomocą plastikowej łyżeczki (Rhinoprobe, Arlington Scientific, Utah). Szczotkowanie i skrobanie nosa powoduje pewien dyskomfort, ale nie wymaga znieczulenia miejscowego. Biopsja nosa jest zwykle wykonywana przez specjalistę z dolnej krawędzi małżowiny nosowej dolnej. Jest to traumatyczna procedura, która wymaga starannego znieczulenia miejscowego, ale uzyskuje się wycinek nabłonka błony śluzowej wraz z błoną podstawną i tkanką podśluzówkową.

Prowokacja alergenem nosa (NAC) ma udowodnione korzyści w testowaniu nowej terapii przeciwzapalnej alergicznego nieżytu nosa i astmy.

NAC ma przewagę nad prowokacją alergenem wziewnym, ponieważ łatwiej jest rekrutować pacjentów, jest mniej inwazyjna i łatwo uzyskuje się powtarzalne próbki tkanek. Niewielkim grupom pacjentów można podawać nawet pojedyncze dawki terapii i odnotowywać przeciwzapalne i kliniczne efekty odpowiedzi NAC. Stosując te metody prowokacyjne w fazie II opracowywania leków na astmę i alergiczny nieżyt nosa, możliwe jest podjęcie wczesnej i wiarygodnej decyzji „Go/No Go” przed rozpoczęciem szeroko zakrojonych, długoterminowych i kosztownych badań fazy III.

Mamy nadzieję opracować analogiczny model prowokacji dla POChP, oceniając skutki prowokacji donosowej dymem papierosowym.

Głównym wyzwaniem jest opracowanie projektów farmakologii klinicznej fazy IIa, które można wykorzystać do oceny leków przeciwzapalnych opracowywanych na POChP. Reakcje nabłonkowe i zapalne błony śluzowej nosa na ekspozycję na ozon były szeroko badane [31-39]. Rzeczywiście, POChP charakteryzuje się przewlekłym stanem zapalnym z zaburzeniem równowagi poziomów utleniaczy/przeciwutleniaczy, a ogólnoustrojowe zapalenie może wywoływać lokalny stres oksydacyjny wywołany wysiłkiem fizycznym.

Trzyletnie badania kliniczne z udziałem tysięcy pacjentów wykazały, że wziewne kortykosteroidy nie wpływają na przyspieszoną utratę funkcji płuc w przebiegu POChP. Co więcej, trwające badania fazy III z doustnymi inhibitorami fosfodiesterazy typu 4 (PDE4) również nie są przekonujące, mimo że początkowe mniejsze badania wyglądają obiecująco. Istnieje wyraźna nieodparta potrzeba opracowania nieinwazyjnych biomarkerów i modeli prowokacji klinicznej do wykorzystania w klinicznych badaniach farmakologicznych II fazy, aby umożliwić wiarygodną ocenę efektów terapii przeciwzapalnej w POChP.

Wykorzystanie modeli prowokacji do nosa w połączeniu z czułymi biomarkerami i klinicznymi punktami końcowymi mogłoby być prawdopodobnie wykorzystane do ustalenia skuteczności klinicznej nowych leków na POChP w badaniach na małą skalę. Nowe terapie mają potencjał selektywnego hamowania różnych typów komórek i poszczególnych mediatorów zaangażowanych w różne choroby zapalne. Uważamy, że prowokacja nosowa alergenem ma przewagę nad prowokacją wziewną: bezpieczeństwo, powtarzanie nieinwazyjnego pobierania próbek.

W przyszłości zapewni to, że prowokacja donosowa będzie odgrywać coraz większą rolę w klinicznej ocenie farmakologicznej terapii przeciwzapalnej. Trwają duże wysiłki w celu opracowania modeli prowokacji do nosa, które naśladują stan zapalny występujący w POChP, które można wykorzystać w klinicznej ocenie farmakologicznej nowych leków przeciwzapalnych.

Prowokacja pełnej krwi in vitro dymem papierosowym Próbki krwi w laboratorium będziemy stymulować w sposób in vitro ekstraktem z dymu papierosowego. Wyciąg z dymu papierosowego wytwarzany jest w dygestorium zapewniającym bezpieczeństwo personelu laboratorium. Dym papierosowy zawiera wiele toksycznych związków, w tym wolne rodniki i utleniacze. Pożywkę kondycjonowaną dymem papierosowym (CSCM) wytwarza się przez przepuszczanie dymu z palących się papierosów przez buforowany roztwór soli, co można wykorzystać do stymulacji komórek in vitro. Wykazano, że ekstrakt z dymu papierosowego jest cytotoksyczny dla linii komórkowej pochodzącej z pęcherzyków płucnych typu II, a efekt ten może być blokowany przez N-acetylocysteinę, zmiatacz utleniaczy. {Hoshino, Mio i in. 2001 7463 /id}. Opracowaliśmy metody oceny regulacji w górę neutrofili CD11b w odpowiedzi na stymulację cytokinami i chemokinami. CD11b jest receptorem powierzchniowym komórki na leukocytach, który jest mobilizowany z magazynów wewnątrzkomórkowych, gdy komórki są stymulowane. Powierzchniowy CD11b można zmierzyć stosując przeciwciała znakowane fluorescencyjnie i cytometrię przepływową. Opracowaliśmy metodę stymulacji krwi pełnej za pomocą CSCM, która powoduje 200% wzrost regulacji w górę CD11b po inkubacji przez 20 minut. Efekt ten jest jeszcze większy, jeśli przed stymulacją usunie się osocze z krwi pełnej, a efekt ten można częściowo zahamować przez obecność zredukowanego glutationu. Wykazano, że pacjenci z POChP i palacze mają zmniejszoną zdolność antyoksydacyjną w osoczu. Naszym celem jest porównanie odpowiedzi neutrofili na stymulację CSCM w krwi pełnej i krwi przemytej, z której usunięto osocze, w celu porównania odpowiedzi neutrofili między pacjentami z POChP i palaczami oraz możliwe przeciwutleniające działanie osocza.

Przegląd planowanych badań

Do tego badania zostaną włączone dwie scharakteryzowane, dopasowane grupy palaczy z POChP i „zdrowych” palaczy, którzy nie mają chorób płuc. Każda grupa składać się będzie z 8 przedmiotów. Każdy uczestnik będzie musiał odbyć 2 wizyty w Jednostce Badań Klinicznych NHLI w następujący sposób:

Wizyta 1: Badanie przesiewowe Podczas badania przesiewowego kandydaci do badania zostaną w pełni poinformowani o charakterze badania i możliwych zdarzeniach niepożądanych. Kandydaci muszą przeczytać formularz zgody i podpisać dokument po tym, jak badacz odpowie na wszystkie pytania w sposób zadowalający kandydata. Dalsze procedury można rozpocząć dopiero po podpisaniu formularza zgody. Dwie oryginalne kopie formularza świadomej zgody zostaną podpisane przez uczestnika. Oryginał podpisanego formularza zgody zostanie zatrzymany przez badacza, a drugi oryginał zostanie przekazany kandydatowi do zabrania do domu.

Kandydaci zostaną poddani ocenie przed przystąpieniem do badania zgodnie z określonymi kryteriami włączenia i wyłączenia. Następujące procedury zostaną przeprowadzone w celu ustalenia ogólnego stanu zdrowia i kwalifikacji każdego kandydata do włączenia do badania:

• Uzyskaj podpisaną, pisemną świadomą zgodę
• Zapisz historię leczenia w ciągu ostatnich 30 dni Zapisz historię medyczną, w tym status palenia
• Wykonaj badanie fizykalne serca, płuc i nosa
• Test ciążowy dla kobiet w wieku rozrodczym
• Wykonaj spirometrię i zbadaj odwracalność
• Przejrzyj kryteria włączenia i wyłączenia

Badacz oceni wyniki wszystkich badań, w tym klinicznych testów laboratoryjnych, i określi przydatność każdego kandydata do badania. Gdy osobnik jest odpowiedni do badania, zostanie pobrana próbka krwi (10 ml) do prowokacji krwi pełnej dymem papierosowym.

Wizyta 2: Prowokacja wdychania dymu przez nos Każdemu pacjentowi wolno palić co najmniej 5 papierosów w godzinach od 9:00 do 21:00 w dniu poprzedzającym wizytę na oddziale iw ciągu poprzednich 7 dni. W dniu badania każdy pacjent zostanie poproszony o wypalenie jednego papierosa, ale wydychanie go przez nos.

Po tym papierosowym wyzwaniu przeprowadzimy następujące procedury przez okres 8 godzin (pre(x2), 1h, 2h, 3h, 4h, 6h and 8h):

1. Płukanie nosa polega na przepłukaniu nosa 5 ml (łyżeczka) ciepłego roztworu soli. Ten roztwór delikatnie przepuszcza się ze strzykawki przez wydrążoną „oliwkę” do końca lewego nozdrza. Płyn nie dostaje się do zatok ani nie przechodzi przez tylną część nosa. W każdym punkcie czasowym zostaną przeprowadzone łącznie 2 spłukiwania.
2. Bibuła filtracyjna do nosa składa się z pasków bibuły o wymiarach 7 mm x 30 mm, które delikatnie umieszcza się wewnątrz końca prawego nozdrza. Pozostawia się je tam do 2 minut, aż będą wilgotne od wydzieliny z nosa.
3. Zostanie wprowadzona kaniula, aby umożliwić pobranie krwi w powyższych punktach czasowych do analizy cytokin i chemokin w surowicy.
4. Test ciążowy tylko dla kobiet w wieku rozrodczym.

W ramach badania osoby badane zostaną poinformowane o szkodliwości palenia papierosów oraz pouczone o konieczności zaprzestania palenia. Pacjenci otrzymają zajęcia z palenia, aby pomóc im rzucić palenie. Przewiduje się, że dzień nauki zostanie ustalony jako data rzucenia palenia dla badanych.