Provocação Nasal com Fumaça de Cigarro e Sangue Total em Pacientes com Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC)

Introdução A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é uma doença respiratória comum que causa morbidade e mortalidade generalizadas, o Global Burden of Disease Study estima que a DPOC seja atualmente a sexta causa mais comum de morte em todo o mundo. Décadas de tabagismo são de longe o principal fator contribuinte, e isso causa uma série de distúrbios respiratórios; incluindo bronquite crônica, bronquiolite obstrutiva, enfisema e doença vascular pulmonar. O tratamento médico da DPOC é amplamente paliativo; envolvendo cessação do tabagismo, uso de broncodilatadores inalatórios e oxigenoterapia de longo prazo para insuficiência respiratória. Recentemente, foi reconhecido que os fumantes que desenvolvem DPOC têm amplificação da inflamação em comparação com "fumantes saudáveis", e que há uma necessidade urgente de desenvolver novos modelos de desafio para avaliar por que a DPOC se desenvolve em alguns fumantes pesados.

Modelo de desafio nasal de fumaça de cigarro O nariz é uma parte acessível do sistema respiratório, da qual é possível obter exsudatos teciduais e escovações celulares de maneira não invasiva. Uma revisão abrangente da extensa experiência em pesquisa clínica com essas metodologias nasais foi publicada recentemente. Há também a percepção de que os pacientes com DPOC comumente apresentam inflamação tanto das vias aéreas quanto das fossas nasais, com um tipo semelhante de infiltrado inflamatório nas vias aéreas inferiores e superiores. Na DPOC, a inflamação envolve predominantemente neutrófilos e macrófagos, em oposição ao aumento de mastócitos e eosinófilos característico da asma.

Há muito se reconhece que existe uma forte relação funcional e imunológica entre o nariz e os brônquios, especialmente em termos de infiltração de leucócitos e mediadores inflamatórios quando se compara rinite alérgica e asma alérgica. As vias aéreas superiores e inferiores têm epitélio respiratório relacionado e respostas semelhantes ao desafio com alérgenos.

A mucosa nasal e brônquica de fumantes com DPOC demonstrou infiltração de linfócitos T CD8+ e neutrófilos. Isso corresponde à presença de sintomas nasais durante as exacerbações da DPOC, e os níveis de IL-8 no escarro e nasais estão correlacionados na DPOC.

Para coletar exsudatos nasais para mediadores inflamatórios alérgicos, os métodos clássicos de lavagem nasal são os descritos por Naclerio et al., o método da piscina nasal de Greiff et al., e o uso do cateter de Foley por Grünberg e colegas. A lavagem é realizada com soro fisiológico em volumes entre 1 e 10ml. A repetibilidade e validade de diferentes métodos de lavagem nasal foram comparadas.

Tommy Sim e colegas desenvolveram o uso de tiras de papel filtro, que são colocadas nos cornetos para absorver as secreções nasais. O método do papel de filtro nasal tem a vantagem de amostrar diretamente as secreções nasais que são menos diluídas e, portanto, pode captar sinais de proteínas que estão abaixo dos limites de detecção da lavagem nasal. O método de matriz ou papel de filtro tem sido usado para medir quimiocinas e citocinas após NAC.

Amostras de células podem ser obtidas da mucosa nasal usando pequenas escovas de fio dental de náilon que são giradas suavemente sobre o epitélio e, em seguida, as células aderidas são desalojadas em solução salina balanceada. Foi demonstrado que a escovação nasal pode ser usada como uma alternativa à biópsia nasal [24], enquanto os sobrenadantes da escova nasal podem ser analisados ​​quanto à liberação de citocinas [25]. Um método alternativo é empregar raspados da mucosa nasal usando uma cureta de plástico (Rhinoprobe, Arlington Scientific, Utah). A escovação e raspagem nasal causam algum desconforto, mas não requerem anestesia local. A biópsia nasal geralmente é realizada a partir da borda inferior do corneto inferior por um especialista. Este é um procedimento traumático que requer anestesia local cuidadosa, mas é obtido um espécime de epitélio da mucosa com membrana basal e tecido submucoso.

O desafio nasal com alérgenos (NAC) é um benefício comprovado para testar novas terapias anti-inflamatórias para rinite alérgica e asma.

A NAC tem vantagens sobre a provocação com alergénios inalados, uma vez que é mais fácil recrutar indivíduos, é menos invasiva e amostras de tecido repetidas são facilmente obtidas. Pequenos números de pacientes podem receber até mesmo doses únicas de terapia, e os efeitos anti-inflamatórios e clínicos nas respostas NAC observados. Usando esses métodos de desafio na fase II do desenvolvimento de medicamentos para asma e rinite alérgica, é possível fornecer uma decisão "Go/No Go" precoce e confiável antes de embarcar em estudos de fase III em larga escala, de longo prazo e caros.

Esperamos desenvolver um modelo de provocação análogo para a DPOC avaliando os efeitos da provocação nasal com fumaça de cigarro.

Um grande desafio é desenvolver projetos de farmacologia clínica de fase IIa que possam ser usados ​​para avaliar os medicamentos anti-inflamatórios desenvolvidos para a DPOC. As respostas epiteliais e inflamatórias nasais à exposição ao ozônio têm sido muito estudadas [31-39]. De fato, a DPOC é caracterizada por inflamação crônica com um desequilíbrio nos níveis de oxidante/antioxidante, e a inflamação sistêmica pode desencadear estresse oxidativo local induzido pelo exercício.

Ensaios clínicos de três anos envolvendo milhares de pacientes descobriram que os corticosteróides inalados não afetam a perda acelerada da função pulmonar na DPOC. Além disso, os ensaios de fase III em andamento com inibidores orais da fosfodiesterase tipo 4 (PDE4) também não são convincentes, apesar dos estudos iniciais menores parecerem promissores. Existe claramente a necessidade imperiosa de desenvolver biomarcadores não invasivos e modelos de desafio clínico para uso em estudos de farmacologia clínica de fase II para permitir uma avaliação confiável dos efeitos da terapia anti-inflamatória na DPOC.

O uso de modelos de provocação nasal acoplados a biomarcadores sensíveis e desfechos clínicos talvez possa ser usado para estabelecer a eficácia clínica de novos medicamentos para a DPOC em estudos de pequena escala. Novas terapias têm o potencial de inibir seletivamente vários tipos de células e mediadores particulares envolvidos em diversas doenças inflamatórias. Acreditamos que a provocação com alérgenos nasais tem vantagens sobre a provocação inalada: segurança, repetição de amostragem não invasiva.

No futuro, isso garantirá que o desafio nasal desempenhe um papel crescente na avaliação farmacológica clínica da terapia anti-inflamatória. Grandes esforços estão em andamento para desenvolver modelos de provocação nasal para mimetizar a inflamação encontrada na DPOC, que podem ser usados ​​na avaliação da farmacologia clínica de novos anti-inflamatórios.

Teste de sangue total in vitro com fumaça de cigarro Estimularemos amostras de sangue em laboratório de maneira in vitro com extrato de fumaça de cigarro. O extrato de fumaça de cigarro é produzido em uma capela de exaustão garantindo a segurança do pessoal do laboratório. A fumaça do cigarro contém muitos compostos tóxicos, incluindo radicais livres e oxidantes. O meio condicionado de fumaça de cigarro (CSCM) é feito borbulhando a fumaça da queima de cigarros através de solução salina tamponada, e isso pode ser usado para estimular células in vitro. Demonstrou-se que o extrato de fumaça de cigarro é citotóxico para uma linhagem derivada de células alveolares tipo II e esse efeito pode ser bloqueado por N-acetilcisteína, um eliminador de oxidantes. {Hoshino, Mio, e outros. 2001 7463 /id}. Desenvolvemos métodos para avaliar a regulação positiva de CD11b de neutrófilos em resposta à estimulação com citocinas e quimiocinas. CD11b é um receptor de superfície celular em leucócitos que é mobilizado a partir de estoques intracelulares quando as células são estimuladas. O CD11b de superfície pode ser medido usando anticorpos marcados com fluorescência e citometria de fluxo. Desenvolvemos um método de estimulação de sangue total com CSCM que produz um aumento de 200% na regulação positiva de CD11b após incubação por 20 minutos. Este efeito aumenta ainda mais se o plasma for removido do sangue total antes da estimulação, e o efeito pode ser parcialmente inibido pela presença de glutationa reduzida. Pacientes com DPOC e fumantes demonstraram ter capacidade antioxidante diminuída em seu plasma. Nosso objetivo é comparar as respostas dos neutrófilos à estimulação CSCM em sangue total e sangue lavado onde o plasma foi removido, para comparar a resposta dos neutrófilos entre pacientes com DPOC e fumantes e possíveis efeitos antioxidantes do plasma.

Visão geral da pesquisa planejada

Dois grupos pareados caracterizados de fumantes com DPOC e fumantes "saudáveis" que não têm doença pulmonar serão incluídos neste estudo. Cada grupo será composto por 8 sujeitos. Cada sujeito será obrigado a fazer 2 visitas à Unidade de Estudos Clínicos do NHLI da seguinte forma:

Visita 1: Triagem Durante a triagem, os candidatos ao estudo serão totalmente informados sobre a natureza do estudo e possíveis EAs. Os candidatos devem ler o formulário de consentimento e assinar o documento depois que o investigador tiver respondido a todas as perguntas de forma satisfatória para o candidato. Outros procedimentos podem começar somente após a assinatura do formulário de consentimento. Duas cópias originais do formulário de consentimento informado serão assinadas pelo sujeito. Um formulário de consentimento original assinado será retido pelo investigador e o segundo original será entregue ao candidato para levar para casa.

Os candidatos serão avaliados para entrada no estudo de acordo com os critérios de inclusão e exclusão declarados. Os seguintes procedimentos serão realizados para estabelecer a saúde geral de cada candidato e as qualificações para inscrição no estudo:

• Obter consentimento informado assinado e por escrito
• Registrar o histórico de medicamentos nos últimos 30 dias Registrar o histórico médico, incluindo tabagismo
• Realizar um exame físico do coração, pulmão e nariz
• Teste de gravidez para mulheres em idade fértil
• Realizar espirometria e reversibilidade do teste
• Revise os critérios de inclusão e exclusão

O investigador avaliará os resultados de todos os exames, incluindo testes laboratoriais clínicos, e determinará a adequação de cada candidato para o estudo. Quando o sujeito for adequado para o estudo, uma amostra de sangue (10mls) será coletada para teste de sangue total com fumaça de cigarro.

Visita 2: Desafio de fumaça nasal Cada indivíduo poderá fumar pelo menos 5 cigarros entre 9h e 21h no dia anterior ao comparecimento à unidade e nos 7 dias anteriores. No dia do estudo, cada paciente será solicitado a fumar um único cigarro, mas exalando pelo nariz.

Após este desafio do cigarro, iremos realizar os seguintes procedimentos durante um período de 8 horas (pré(x2), 1h, 2h, 3h, 4h,6h e 8h):

1. A lavagem nasal consiste em lavar o nariz com 5ml (uma colher de chá) de solução salina morna. Esta solução é passada suavemente de uma seringa através de uma "azeitona" oca até o final da narina esquerda. O fluido não entra nos seios da face nem passa pela parte de trás do nariz. Um total de 2 descargas serão realizadas em cada ponto de tempo.
2. O papel de filtro nasal consiste em tiras de papel de 7 mm x 30 mm que são colocadas suavemente dentro da extremidade da narina direita. Eles são deixados lá por até 2 minutos até ficarem úmidos com secreções nasais.
3. Uma cânula será inserida para permitir que o sangue seja coletado nos pontos de tempo acima para análise sérica de citocinas e quimiocinas.
4. Teste de gravidez apenas para mulheres em idade reprodutiva.

Como parte do estudo, os participantes serão informados sobre os efeitos nocivos do tabagismo e aconselhados sobre a necessidade de parar de fumar. Os indivíduos receberão aulas de tabagismo para ajudá-los a parar de fumar. Prevê-se que o dia de estudo será definido como a data de saída para os assuntos.