Fumo di sigaretta Sfida nasale e sangue intero nei pazienti con broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO)

Introduzione La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è una malattia respiratoria comune che causa morbilità e mortalità diffuse, il Global Burden of Disease Study stima che la BPCO sia attualmente la sesta causa di morte più comune al mondo. Decenni di fumo di sigaretta sono di gran lunga il principale fattore che contribuisce e questo causa una serie di disturbi respiratori; tra cui bronchite cronica, bronchiolite ostruttiva, enfisema e malattia vascolare polmonare. Il trattamento medico della BPCO è in gran parte palliativo; coinvolgendo la cessazione del fumo, l'uso di broncodilatatori per via inalatoria e l'ossigenoterapia a lungo termine per l'insufficienza respiratoria. Recentemente, è stato riconosciuto che i fumatori che sviluppano la BPCO hanno un'amplificazione dell'infiammazione rispetto ai "fumatori sani" e che c'è l'urgente necessità di sviluppare nuovi modelli di sfida per valutare perché la BPCO si sviluppa in alcuni forti fumatori.

Fumo di sigaretta Nasal Challenge Model Il naso è una parte accessibile dell'apparato respiratorio, da cui è possibile ottenere essudati tissutali e spazzolamenti cellulari in modo non invasivo. Recentemente è stata pubblicata una revisione completa della vasta esperienza di ricerca clinica con queste metodologie nasali. C'è anche l'intuizione che i pazienti con BPCO hanno comunemente un'infiammazione sia delle vie aeree che dei passaggi nasali, con un tipo simile di infiltrato infiammatorio nelle vie aeree inferiori e superiori. Nella BPCO l'infiammazione coinvolge prevalentemente neutrofili e macrofagi, in contrasto con l'aumento dei mastociti e degli eosinofili caratteristico dell'asma.

È da tempo riconosciuto che esiste una forte relazione funzionale e immunologica tra naso e bronchi, soprattutto in termini di leucociti infiltranti e mediatori infiammatori quando si confrontano rinite allergica e asma allergico. Le vie aeree superiori e inferiori hanno un epitelio respiratorio correlato e risposte simili alla sfida con gli allergeni.

È stato dimostrato che la mucosa nasale e bronchiale dei fumatori con BPCO è infiltrata da linfociti T CD8+ e neutrofili. Ciò corrisponde alla presenza di sintomi nasali durante le riacutizzazioni della BPCO e i livelli di IL-8 nell'espettorato e nel naso sono correlati nella BPCO.

Per campionare gli essudati nasali per i mediatori infiammatori allergici, i metodi classici di lavaggio nasale sono quelli descritti da Naclerio et al., il metodo del pool nasale di Greiff et al., e l'uso di un catetere di Foley di Grünberg e colleghi. Il lavaggio viene eseguito con soluzione fisiologica a volumi compresi tra 1 e 10 ml. Sono state confrontate la ripetibilità e la validità di diversi metodi di lavaggio nasale.

Tommy Sim e colleghi hanno sviluppato l'uso di strisce di carta da filtro, che vengono posizionate sui turbinati per assorbire le secrezioni nasali. Il metodo della carta da filtro nasale ha il vantaggio di campionare direttamente le secrezioni nasali che sono meno diluite e possono quindi raccogliere segnali proteici che sono al di sotto dei limiti di rilevazione del lavaggio nasale. Il metodo della matrice o della carta da filtro è stato utilizzato per misurare le chemochine e le citochine dopo NAC.

I campioni di cellule possono essere ottenuti dalla mucosa nasale utilizzando piccoli spazzolini per filo interdentale in nylon che vengono delicatamente ruotati sull'epitelio, quindi le cellule attaccate vengono rimosse in una soluzione salina bilanciata. È stato dimostrato che lo spazzolamento nasale può essere utilizzato in alternativa alla biopsia nasale [24], mentre i surnatanti dello spazzolamento nasale possono essere analizzati per il rilascio di citochine [25]. Un metodo alternativo consiste nell'utilizzare raschiati della mucosa nasale utilizzando una curette di plastica (Rhinoprobe, Arlington Scientific, Utah). Lo spazzolamento e il raschiamento nasale provocano disagio ma non richiedono anestesia locale. La biopsia nasale viene generalmente eseguita dal bordo inferiore del turbinato inferiore da uno specialista. Questa è una procedura traumatica che richiede un'attenta anestesia locale, ma si ottiene un campione di epitelio della mucosa con membrana basale e tessuto sottomucoso.

Nasal allergen challenge (NAC) è di comprovato beneficio per testare una nuova terapia antinfiammatoria per la rinite allergica e l'asma.

NAC presenta vantaggi rispetto alla sfida con allergeni inalati poiché è più facile reclutare soggetti, è meno invasivo e si ottengono facilmente campioni di tessuto ripetuti. A un piccolo numero di pazienti possono essere somministrate anche singole dosi di terapia e sono stati notati gli effetti antinfiammatori e clinici sulle risposte NAC. Utilizzando questi metodi di sfida nella fase II dello sviluppo di farmaci per l'asma e la rinite allergica è possibile fornire una decisione tempestiva e affidabile "Go/No Go" prima di intraprendere studi di fase III su larga scala, a lungo termine e costosi.

Speriamo di sviluppare un modello di provocazione analogo per la BPCO valutando gli effetti della provocazione nasale con il fumo di sigaretta.

Una sfida importante è sviluppare progetti di farmacologia clinica di fase IIa che possano essere utilizzati per valutare i farmaci antinfiammatori in fase di sviluppo per la BPCO. Le risposte epiteliali e infiammatorie nasali all'esposizione all'ozono sono state molto studiate [31-39]. Infatti la BPCO è caratterizzata da infiammazione cronica con uno squilibrio nei livelli ossidanti/antiossidanti e l'infiammazione sistemica può innescare lo stress ossidativo indotto dall'esercizio locale.

Studi clinici di tre anni che hanno coinvolto migliaia di pazienti hanno scoperto che i corticosteroidi per via inalatoria non influenzano la velocità di perdita accelerata della funzione polmonare nella BPCO. Inoltre, anche gli studi di fase III in corso con inibitori orali della fosfodiesterasi di tipo 4 (PDE4) non sono convincenti, nonostante gli studi iniziali più piccoli sembrino promettenti. Esiste chiaramente la necessità impellente di sviluppare biomarcatori non invasivi e modelli di sfida clinica da utilizzare negli studi di farmacologia clinica di fase II per consentire una valutazione affidabile degli effetti della terapia antinfiammatoria nella BPCO.

L'uso di modelli di provocazione nasale accoppiati a biomarcatori sensibili e endpoint clinici potrebbe forse essere utilizzato per stabilire l'efficacia clinica di nuovi farmaci per la BPCO in studi su piccola scala. Nuove terapie hanno il potenziale per inibire selettivamente vari tipi di cellule e particolari mediatori coinvolti in diverse malattie infiammatorie. Riteniamo che il test con allergeni nasali presenti dei vantaggi rispetto al test per via inalatoria: sicurezza, ripetizione del campionamento non invasivo.

In futuro ciò garantirà che il test nasale svolga un ruolo crescente nella valutazione farmacologica clinica della terapia antinfiammatoria. Sono in corso importanti sforzi per sviluppare modelli di sfida nasale per imitare l'infiammazione riscontrata nella BPCO, che possono essere utilizzati nella valutazione farmacologica clinica di nuovi farmaci antinfiammatori.

Whole Blood Challenge in vitro con fumo di sigaretta Stimoleremo i campioni di sangue in laboratorio in modo in vitro con un estratto di fumo di sigaretta. L'estratto di fumo di sigaretta viene prodotto in una cappa aspirante che garantisce la sicurezza del personale di laboratorio. Il fumo di sigaretta contiene molti composti tossici inclusi i radicali liberi e gli ossidanti. Il mezzo condizionato dal fumo di sigaretta (CSCM) viene prodotto facendo gorgogliare il fumo delle sigarette accese attraverso una soluzione salina tamponata, e questo può essere utilizzato per stimolare le cellule in vitro. È stato dimostrato che l'estratto di fumo di sigaretta è citotossico per una linea derivata da cellule alveolari di tipo II e questo effetto può essere bloccato dall'N-acetil cisteina, uno scavenger di ossidanti. {Hoshino, Mio, et al. 2001 7463 /id}. Abbiamo sviluppato metodi per valutare la sovraregolazione del CD11b dei neutrofili in risposta alla stimolazione con citochine e chemochine. CD11b è un recettore della superficie cellulare sui leucociti che viene mobilizzato dai depositi intracellulari quando le cellule vengono stimolate. La superficie CD11b può essere misurata utilizzando anticorpi marcati con fluorescenza e citometria a flusso. Abbiamo sviluppato un metodo per stimolare il sangue intero con CSCM che produce un aumento del 200% della sovraregolazione del CD11b dopo un'incubazione di 20 minuti. Questo effetto è ulteriormente aumentato se il plasma viene rimosso dal sangue intero prima della stimolazione e l'effetto può essere parzialmente inibito dalla presenza di glutatione ridotto. È stato dimostrato che i pazienti con BPCO e i fumatori hanno una ridotta capacità antiossidante nel loro plasma. Miriamo a confrontare le risposte dei neutrofili alla stimolazione CSCM nel sangue intero e nel sangue lavato in cui il plasma è stato rimosso, per confrontare la risposta dei neutrofili tra pazienti con BPCO e fumatori e possibili effetti antiossidanti del plasma.

Panoramica della ricerca pianificata

Per questo studio saranno arruolati due gruppi di fumatori con BPCO e fumatori "sani" che non hanno malattie polmonari. Ogni gruppo sarà composto da 8 soggetti. Ogni soggetto dovrà effettuare 2 visite all'Unità di studi clinici NHLI come segue:

Visita 1: Screening Durante lo screening, i candidati allo studio saranno pienamente informati sulla natura dello studio e sui possibili eventi avversi. I candidati devono leggere il modulo di consenso e firmare il documento dopo che lo sperimentatore ha risposto a tutte le domande in modo soddisfacente per il candidato. Ulteriori procedure possono iniziare solo dopo la firma del modulo di consenso. Due copie originali del modulo di consenso informato saranno firmate dal soggetto. Un modulo di consenso firmato in originale sarà conservato dallo sperimentatore e il secondo originale sarà consegnato al candidato perché lo porti a casa.

I candidati saranno valutati per l'ingresso nello studio in base ai criteri di inclusione ed esclusione dichiarati. Verranno eseguite le seguenti procedure per stabilire lo stato di salute generale e le qualifiche di ciascun candidato per l'iscrizione allo studio:

• Ottenere il consenso informato firmato e scritto
• Registrare la storia medica negli ultimi 30 giorni Registrare la storia medica, incluso lo stato di fumo
• Eseguire un esame fisico di cuore, polmoni e naso
• Test di gravidanza per soggetti di sesso femminile in età fertile
• Eseguire la spirometria e testare la reversibilità
• Rivedere i criteri di inclusione ed esclusione

Lo sperimentatore valuterà i risultati di tutti gli esami, compresi i test clinici di laboratorio, e determinerà l'idoneità di ciascun candidato allo studio. Quando il soggetto è idoneo allo studio, verrà prelevato un campione di sangue (10 ml) per il test del sangue intero con fumo di sigaretta.

Visita 2: sfida del fumo nasale Ogni soggetto potrà fumare almeno 5 sigarette tra le 9:00 e le 21:00 del giorno prima di frequentare l'unità e nei 7 giorni precedenti. Il giorno dello studio, ad ogni paziente verrà chiesto di fumare una sola sigaretta ma espirando dal naso.

Dopo questa sfida con la sigaretta, eseguiremo le seguenti procedure per un periodo di 8 ore (pre(x2), 1h, 2h, 3h, 4h,6h e 8h):

1. Il lavaggio nasale consiste nel lavare il naso con 5 ml (un cucchiaino) di soluzione salina calda. Questa soluzione viene fatta passare delicatamente da una siringa attraverso una "oliva" cava all'estremità della narice sinistra. Il fluido non entra nei seni né passa lungo la parte posteriore del naso. Verranno eseguiti un totale di 2 lavaggi in ogni timepoint.
2. La carta da filtro nasale è costituita da strisce di carta da 7 mm x 30 mm che vengono posizionate delicatamente all'interno dell'estremità della narice destra. Vengono lasciati lì per un massimo di 2 minuti finché non sono umidi di secrezioni nasali.
3. Verrà inserita una cannula per consentire il prelievo di sangue nei punti temporali sopra indicati per l'analisi sierica di citochine e chemochine.
4. Test di gravidanza solo per soggetti di sesso femminile in età fertile.

Come parte dello studio, i soggetti saranno informati degli effetti dannosi del fumo di sigaretta e avvisati della necessità di smettere di fumare. Ai soggetti verranno offerte lezioni di fumo per aiutarli a smettere di fumare. Si prevede che il giorno di studio sarà fissato come data di uscita dei soggetti.