Tupakansavun aiheuttama nenä- ja kokoverihaaste potilailla, joilla on krooninen obstruktiivinen keuhkosairaus (COPD)

Johdanto Krooninen obstruktiivinen keuhkosairaus (COPD) on yleinen hengitystiesairaus, joka aiheuttaa laajaa sairastuvuutta ja kuolleisuutta. Global Burden of Disease Study -tutkimuksen mukaan COPD on tällä hetkellä kuudenneksi yleisin kuolinsyy maailmanlaajuisesti. Vuosikymmeniä jatkunut tupakointi on ylivoimaisesti suurin myötävaikuttava tekijä, ja tämä aiheuttaa useita hengityselinten häiriöitä; mukaan lukien krooninen keuhkoputkentulehdus, obstruktiivinen bronkioliitti, emfyseema ja keuhkoverisuonisairaus. Keuhkoahtaumataudin lääketieteellinen hoito on suurelta osin palliatiivista; mukaan lukien tupakoinnin lopettaminen, hengitettyjen keuhkoputkia laajentavien lääkkeiden käyttö ja pitkäaikainen happihoito hengitysvajauksen hoitoon. Viime aikoina on havaittu, että niillä tupakoitsijoilla, joille kehittyy keuhkoahtaumatauti, tulehdus voimistuu "terveisiin tupakoitsijoihin" verrattuna, ja että on kiireesti kehitettävä uusia haastemalleja arvioimaan, miksi keuhkoahtaumatauti kehittyy joillakin raskaalla tupakoitsijoilla.

Tupakansavu-nenähaastemalli Nenä on helposti saavutettava osa hengityselimiä, josta on mahdollista saada kudosnesteitä ja soluharjauksia ei-invasiivisella tavalla. Kattava katsaus laajasta kliinisestä tutkimuskokemuksesta näillä nenämenetelmillä on äskettäin julkaistu. On myös näkemys siitä, että keuhkoahtaumatautia sairastavilla potilailla on yleensä tulehdus sekä hengitysteissä että nenäkäytävissä, ja alemmissa ja ylemmissä hengitysteissä on samanlainen tulehduksellinen infiltraatti. Keuhkoahtaumataudissa tulehdus koskee pääasiassa neutrofiilejä ja makrofageja, toisin kuin astmalle tyypillinen syöttösolujen ja eosinofiilien lisääntyminen.

On jo pitkään tunnustettu, että nenän ja keuhkoputkien välillä on vahva toiminnallinen ja immunologinen suhde, erityisesti tunkeutuvien leukosyyttien ja tulehdusvälittäjien suhteen verrattaessa allergista nuhaa ja allergista astmaa. Ylemmillä ja alemmilla hengitysteillä on samankaltainen hengitysteiden epiteeli ja samanlaiset vasteet allergeenialtistukseen.

Keuhkoahtaumatautia sairastavien tupakoitsijoiden nenän ja keuhkoputkien limakalvon on osoitettu olevan CD8+ T-lymfosyyttien ja neutrofiilien tunkeutumista. Tämä vastaa nenäoireiden esiintymistä COPD:n pahenemisvaiheiden aikana, ja ysköksen ja nenän IL-8:n tasot korreloivat COPD:ssä.

Nenäeritteiden ottamiseksi allergisten tulehdusvälittäjien näytteenottoa varten klassiset nenähuuhtelumenetelmät ovat Naclerion et ai.:n kuvaamia, Greiffin et al.:n nenäpoolimenetelmää ja Grünbergin ja kollegoiden Foley's-katetrin käyttöä. Huuhtelu suoritetaan suolaliuoksella, jonka tilavuus on 1-10 ml. Eri nenähuuhtelumenetelmien toistettavuutta ja validiteettia on verrattu.

Tommy Sim ja kollegat ovat kehittäneet suodatinpaperiliuskojen käytön, jotka asetetaan turbiinien päälle nenäeritteiden imemiseksi. Nenäsuodatinpaperimenetelmän etuna on se, että nenäeritteet otetaan suoraan näytteistä, jotka ovat vähemmän laimennettuja ja voivat siksi poimia proteiinisignaaleja, jotka ovat nenähuuhtelun havaitsemisrajojen alapuolella. Matriisi- tai suodatinpaperimenetelmää on käytetty kemokiinien ja sytokiinien mittaamiseen NAC:n jälkeen.

Solunäytteitä voidaan ottaa nenän limakalvolta käyttämällä pieniä nailonisia hammaslankaharjoja, joita pyöritetään varovasti epiteelin päällä, ja sitten kiinnittyneet solut irrotetaan tasapainotetussa suolaliuoksessa. On osoitettu, että nenän harjausta voidaan käyttää vaihtoehtona nenän biopsialle [24], kun taas nenäharjan supernatanteista voidaan analysoida sytokiinien vapautuminen [25]. Vaihtoehtoinen menetelmä on käyttää nenän limakalvon raapimista käyttämällä muovikyrettiä (Rhinoprobe, Arlington Scientific, Utah). Nenän harjaus ja kaapiminen aiheuttavat jonkin verran epämukavuutta, mutta eivät vaadi paikallispuudutusta. Nenäkoepalan tekee yleensä asiantuntija alemman turbinaatin alareunasta. Tämä on traumaattinen toimenpide, joka vaatii huolellista paikallispuudutusta, mutta näyte limakalvon epiteelistä, jossa on tyvikalvo ja limakalvonalainen kudos, otetaan.

Nenän allergeenihaaste (NAC) on todistetusti hyödyllinen testattaessa uutta allergisen nuhan ja astman anti-inflammatorista hoitoa.

NAC:lla on etuja inhaloitavaan allergeenihaastukseen verrattuna, koska se on helpompi värvätä koehenkilöitä, se on vähemmän invasiivinen ja toistuvia kudosnäytteitä saadaan helposti. Pienille potilaille voidaan antaa jopa yksittäisiä annoksia hoitoa, ja anti-inflammatoriset ja kliiniset vaikutukset NAC-vasteisiin havaitaan. Käyttämällä näitä haastemenetelmiä astman ja allergisen nuhan lääkekehityksen vaiheessa II on mahdollista tehdä varhainen ja luotettava "Go/No Go" -päätös ennen laajamittaisten, pitkäaikaisten ja kalliiden vaiheen III tutkimusten aloittamista.

Toivomme voivamme kehittää analogisen haastemallin keuhkoahtaumatautiin arvioimalla tupakansavun aiheuttaman nenäaltistuksen vaikutuksia.

Suuri haaste on kehittää vaiheen IIa kliinisen farmakologian suunnitelmia, joita voidaan käyttää keuhkoahtaumatautiin kehitettävien anti-inflammatoristen lääkkeiden arvioinnissa. Nenän epiteelin ja tulehduksellisia vasteita otsonialtistukselle on tutkittu paljon [31-39]. Itse asiassa COPD:lle on ominaista krooninen tulehdus, johon liittyy epätasapaino hapettimien/antioksidanttitasojen välillä, ja systeeminen tulehdus voi laukaista paikallisen harjoituksen aiheuttaman oksidatiivisen stressin.

Kolmen vuoden kliinisissä tutkimuksissa, joihin osallistui tuhansia potilaita, on havaittu, että inhaloitavat kortikosteroidit eivät vaikuta keuhkoahtaumatautiin liittyvien keuhkojen toiminnan nopeutumiseen. Lisäksi meneillään olevat vaiheen III tutkimukset oraalisilla fosfodiesteraasi tyypin 4 (PDE4) estäjillä eivät myöskään ole vakuuttavia, vaikka alkuperäiset pienemmät tutkimukset näyttävät lupaavilta. On selvästi olemassa pakottava tarve kehittää ei-invasiivisia biomarkkereita ja kliinisiä haastemalleja käytettäviksi vaiheen II kliinisen farmakologian tutkimuksissa, jotta keuhkoahtaumatautien anti-inflammatorisen hoidon vaikutuksia voidaan arvioida luotettavasti.

Nenäaltistusmallien käyttöä yhdistettynä herkkiin biomarkkereihin ja kliinisiin päätepisteisiin voitaisiin ehkä käyttää uusien keuhkoahtaumatautilääkkeiden kliinisen tehon määrittämiseen pienimuotoisissa tutkimuksissa. Uusilla hoidoilla on potentiaalia estää selektiivisesti erilaisia ​​solutyyppejä ja tiettyjä välittäjiä, jotka liittyvät erilaisiin tulehdussairauksiin. Uskomme, että nenän allergeenihaastuksella on etuja hengitettyyn altistukseen verrattuna: turvallisuus, toistettava ei-invasiivinen näytteenotto.

Tulevaisuudessa tämä varmistaa, että nenähaaste tulee olemaan kasvava rooli anti-inflammatorisen hoidon kliinisen farmakologian arvioinnissa. Meneillään on suuria ponnisteluja sellaisten nenähaastemallien kehittämiseksi, joka jäljittelee keuhkoahtaumataudissa havaittua tulehdusta ja joita voidaan käyttää uusien tulehduskipulääkkeiden kliinisen farmakologian arvioinnissa.

Kokoverihaaste in vitro tupakansavulla Stimuloidaan verinäytteet laboratoriossa in vitro -tavalla tupakansavuuutteella. Tupakansavuuute valmistetaan savukaapissa varmistaen laboratoriohenkilöstön turvallisuuden. Tupakansavu sisältää monia myrkyllisiä yhdisteitä, mukaan lukien vapaita radikaaleja ja hapettimia. Tupakansavun ilmastoinnin alusta (CSCM) valmistetaan kuplittamalla savukkeiden palamisesta syntyvää savua puskuroidun suolaliuoksen läpi, ja tätä voidaan käyttää solujen stimuloimiseen in vitro. Tupakansavuuutteen on osoitettu olevan sytotoksinen alveolaarisen tyypin II soluperäiselle linjalle, ja tämä vaikutus voidaan estää N-asetyylikysteiinillä, hapettimien poistajalla. {Hoshino, Mio, et ai. 2001 7463 /id}. Olemme kehittäneet menetelmiä neutrofiilien CD11b:n lisääntymisen arvioimiseksi vasteena sytokiinien ja kemokiinien stimulaatiolle. CD11b on leukosyyttien solupinnan reseptori, joka mobilisoituu solunsisäisistä varastoista, kun soluja stimuloidaan. Pinta-CD11b voidaan mitata käyttämällä fluoresoivia leimattuja vasta-aineita ja virtaussytometriaa. Olemme kehittäneet menetelmän kokoveren stimuloimiseksi CSCM:llä, joka lisää 200 % CD11b:n noususäätelyä 20 minuutin inkuboinnin jälkeen. Tämä vaikutus lisääntyy entisestään, jos plasma poistetaan kokoverestä ennen stimulaatiota, ja vaikutus voidaan osittain estää pelkistyneen glutationin läsnäololla. Keuhkoahtaumatautipotilailla ja tupakoitsijoilla on osoitettu plasman heikentyneen antioksidanttikapasiteetin. Pyrimme vertaamaan neutrofiilivasteita CSCM-stimulaatioon kokoveressä ja pestyssä veressä, josta plasma on poistettu, vertaillaksemme neutrofiilien vastetta COPD-potilaiden ja tupakoitsijoiden välillä sekä plasman mahdollisia antioksidanttisia vaikutuksia.

Yleiskatsaus suunnitellusta tutkimuksesta

Tähän tutkimukseen otetaan mukaan kaksi tunnusomaista yhteensopivaa tupakoitsijoiden ryhmää, joilla on keuhkoahtaumatauti ja "terveitä" tupakoitsijoita, joilla ei ole keuhkosairautta. Jokaisessa ryhmässä on 8 oppiainetta. Jokaisen koehenkilön on tehtävä 2 käyntiä NHLI:n kliinisten tutkimusten yksikössä seuraavasti:

Vierailu 1: Seulonta Seulonnan aikana tutkimukseen osallistuvat henkilöt saavat täydelliset tiedot tutkimuksen luonteesta ja mahdollisista haittavaikutuksista. Hakijoiden on luettava suostumuslomake ja allekirjoitettava asiakirja sen jälkeen, kun tutkija on vastannut kaikkiin kysymyksiin ehdokasta tyydyttävällä tavalla. Jatkomenettelyt voidaan aloittaa vasta suostumuslomakkeen allekirjoittamisen jälkeen. Tutkittava allekirjoittaa kaksi alkuperäistä tietoisen suostumuslomakkeen kopiota. Alkuperäinen allekirjoitettu suostumuslomake jää tutkijalle ja toinen alkuperäinen annetaan hakijalle kotiin vietäväksi.

Hakijoiden pääsy tutkimukseen arvioidaan ilmoitettujen mukaanotto- ja poissulkemiskriteerien mukaisesti. Seuraavat toimenpiteet suoritetaan kunkin ehdokkaan yleisen terveyden ja pätevyyden määrittämiseksi tutkimukseen ilmoittautumista varten:

• Hanki allekirjoitettu kirjallinen tietoinen suostumus
• Tallenna lääkityshistoria viimeisten 30 päivän ajalta. Tallenna sairaushistoria, mukaan lukien tupakoinnin tila
• Suorita sydämen, keuhkojen ja nenän fyysinen tutkimus
• Raskaustesti hedelmällisessä iässä oleville naisille
• Suorita spirometria ja testaa palautuvuus
• Tarkista sisällyttämis- ja poissulkemiskriteerit

Tutkija arvioi kaikkien tutkimusten tulokset, mukaan lukien kliiniset laboratoriotutkimukset, ja määrittää kunkin ehdokkaan soveltuvuuden tutkimukseen. Kun kohde soveltuu tutkimukseen, otetaan verinäyte (10 ml) tupakansavun kokoverialtistusta varten.

Vierailu 2: Nenäsavuhaaste Jokainen tutkittava saa polttaa vähintään 5 savuketta klo 9-21 välillä yksikköön osallistumista edeltävänä päivänä ja edellisinä 7 päivänä. Tutkimuspäivänä jokaista potilasta pyydetään polttamaan yksi savuke, mutta hengittämään ulos nenän kautta.

Tämän savukehaasteen jälkeen suoritamme seuraavat toimenpiteet 8 tunnin aikana (pre(x2), 1h, 2h, 3h, 4h, 6h ja 8h):

1. Nenähuuhtelu koostuu nenän pesemisestä 5 ml:lla (tl) lämmintä suolaliuosta. Tämä liuos johdetaan varovasti ruiskusta onton "oliivin" läpi vasemman sieraimen päähän. Neste ei pääse poskionteloihin eikä kulje nenän takaosaa pitkin. Kullakin aikapisteellä suoritetaan yhteensä 2 huuhtelua.
2. Nenän suodatinpaperi koostuu 7 mm x 30 mm:n paperikaistaleista, jotka asetetaan varovasti oikean sieraimen päähän. Ne jätetään sinne enintään 2 minuutiksi, kunnes ne ovat kostutettuja nenäeritteistä.
3. Kanyyli asetetaan, jotta verta voidaan ottaa edellä mainittuina ajankohtina sytokiinien ja kemokiinien seerumianalyysiä varten.
4. Raskaustesti vain hedelmällisessä iässä oleville naisille.

Osana tutkimusta koehenkilöille tiedotetaan tupakoinnin haitallisista vaikutuksista ja neuvotaan tupakoinnin lopettamisen tarpeesta. Tutkijoille tarjotaan tupakointikursseja, jotka auttavat heitä lopettamaan tupakoinnin. Oppiaineiden lopetuspäiväksi on tarkoitus asettaa opintopäivä.