Ischemické předkondicionování jater u dárců kadaverů

Specifické cíle

1. Testovat hypotézu, že 10 minut předkondicionování jaterní ischemie u zemřelých dárců by zlepšilo funkci jaterního štěpu a snížilo poranění v časném období po transplantaci.

   Abychom dosáhli tohoto cíle, porovnáme mezinárodní normalizované poměry protrombinového času (INR/PT) a hladiny aspartátu (AST) a alaninaminotransferázy (ALT) a celkového bilirubinu (TB) bezprostředně po transplantaci a v den 1, 3, 7, 14 a 30 a skóre poškození reperfuzních jaterních biopsií u příjemců jater od IPC a dárců bez IPC.

2. Testovat hypotézu, že ischemická prekondicionace jater zemřelého dárce by snížila systémovou zánětlivou odpověď u příjemců jater v časném období po transplantaci.

   K dosažení tohoto cíle porovnáme plazmatické hladiny cytokinů tumor nekrotizující faktor-alfa (TNF-alfa), interleukinů-6, 8 a 10 (IL-6, 8 a 10) a rozpustného L-selektinu, expresní hladiny adhezních molekul (CD11beta/CD18 a L-selektin) a oxidativní vzplanutí neutrofilů, P-selektinu trombocytů a komplexů trombocytů a neutrofilů (PNC) v periferní krvi 3, 12, 24 a 48 hodin po reperfuzi u příjemců jater z IPC a bez IPC dárců.

3. Zkoumat, zda ischemická preconditioning jater zemřelého dárce snižuje časně posttransplantační plicní edém a akutní rejekci a zkracuje dobu hospitalizace.

K dosažení tohoto cíle porovnáme intersticiální a alveolární edém na rentgenových snímcích hrudníku po transplantaci a 1., 2. a 3. pooperační den; biopsie potvrdila akutní odmítnutí do 30 dnů po transplantaci a počet dní do propuštění po transplantaci u příjemců jater od IPC a dárců bez IPC.

Plán výzkumu Prospektivní, randomizovaná a jednoduše maskovaná studie (příjemci jater) bude provedena v jednom centru transplantace jater po dobu dvou let. Zemřelí dárci jater budou randomizováni ve stejném poměru k jednomu ze dvou postupů obnovy orgánů: 1). IPC nebo 2). Žádné IPC. Alokace bude stratifikována podle věku < 50 nebo věku >= 50, aby se usnadnilo zkoumání účinků věku na IPC. Vzhledem k tomu, že do studie budou zařazováni dárci na období dvou let, přidělení léčby bude vyváženo v blocích délky 12, 16 a 20, přičemž délka bude vybrána náhodně, aby se kontrolovaly časově proměnlivé faktory. Obnovená játra se transplantují příjemcům ve věku > 18 let. Všechny ostatní aspekty managementu dárce, obnovy a uchování orgánů, výběru příjemce, implantace štěpu a posttransplantačního managementu včetně imunosuprese budou v souladu se standardní praxí.

II. Metody výzkumu

1. Zotavení jater a IPC: Dárci jsou umístěni na zádech, mechanicky ventilováni a je jim podáván 100% kyslík a svalový relaxant. Břicho a hrudník jsou otevřeny ve střední čáře. Stručně řečeno, kulaté a falciformní vazy jsou rozděleny a žlučník je naříznut a irigován. Gastroduodenální tepna je podvázána a spojení slezinných a horních mezenterických vén nebo, je-li odběr slinivky břišní, je připravena pro kanylaci dolní mezenterická žíla. Supraceliakální aorta je obnažena těsně pod bránicí. Infrarenální břišní aorta se izoluje pro kanylaci. Před orgánovou perfuzí se neprovádí žádná mobilizace ledvin. Hrudní orgány jsou mobilizovány buď současně nebo před mobilizací břišních orgánů. Intravenózně se podává pět set jednotek/kg heparinu a kanyluje se vzestupná hrudní a infrarenální břišní aorta. Další kanyla se zavádí buď do slezinové žíly nebo dolní mesenterické žíly. Supraceliakální abdominální aorta se upne a dolní dutá žíla se odvzdušní v perikardu. Do břišní aorty a portální žíly (každý 2 litry) se infuzí podá UW roztok (40C). Břišní dutina je plná ledové kaše. Po dokončení orgánové perfuze se postupně odstraní srdce, plíce, játra, slinivka břišní a ledviny. Játra se umístí do plastových sáčků obsahujících litr UW roztoku (40C) a do doby transplantace se zabalí do ledu.

   Ischemická prekondicionace se provádí brzy po otevření břicha sevřením jaterního hilu cévní svorkou na pět minut, což se po pěti minutách reperfuze znovu opakuje. Během IPC je peritoneální dutina kontrolována na krvácení, kongesci a edém slinivky břišní a tenkého střeva.

2. Implantace štěpu: Hepatektomie příjemce se provádí standardním způsobem s kavální konzervací a bez použití venovenózního bypassu. Jaterní štěp se implantuje způsobem na zádech88. Aloštěp je reperfundován po dokončení anastomózy suprahepatické kavální a portální žíly. Štěp je propláchnut přibližně 300 ml krve příjemce, která je odvzdušněna přes infrahepatickou dutou žílu dárce, načež je tato struktura podvázána. Po reperfuzi štěpu jsou dokončeny anastomózy arterií a žlučovodů.
3. Biopsie jater a reperfuzní poranění: Bezprostředně po otevření břicha dárce a před IPC se provede klínová a jehlová biopsie pravého laloku. Další klínová a jehlová biopsie se provádí 90 minut po reperfuzi příjemce. Biopsie jater po transplantaci se provádí pouze v klinicky indikovaných případech. Vzorky fixované formalínem se zalijí do parafínu, nařežou na tenké plátky pět mikronů a obarví hematoxylinem a eosinem. Množství tuku v biopsiích dárců je semikvantitativně odstupňováno následovně89; Žádný tuk = stupeň 0, 1-15 % = stupeň I, 16-30 % = stupeň II, 31-45 % = stupeň III, > 45 % = stupeň IV. Reperfuzní poškození je hodnoceno (0-10 se vzrůstající závažností) vyšetřením 30 vysoce výkonných polí (600x) každé postperfuzní biopsie. Apoptotické buňky se spočítají a otok hepatocytů, krvácení zóny 3 a nekróza se přiřadí semikvantitativnímu skóre90. Očekává se, že reperfuzní skóre v navrhované studii bude v rozmezí 0,5 až 5 na základě naší předchozí práce36. Patolog je maskovaný, pokud jde o skupinové přiřazení všech biopsií.
4. Imunosuprese a akutní rejekce: Všichni pacienti dostávají k imunosupresi takrolimus a steroidy. U pacientů s hepatorenálním syndromem je použití takrolimu odloženo o několik dní a může být použito v mnohem nižší dávce než standardní použití. Farmakologická imunosuprese bude kvantifikována stanovením průměrné dávky steroidu za den, průměru týdenního mediánu hladiny takrolimu po dobu prvních pěti týdnů a podílu příjemců v každé skupině, kteří mohou dostávat další látky, jako je mykofenolát a protilátka proti IL-2 receptoru . Imunosuprese způsobená jaterním selháním příjemce bude hodnocena jejich modelem pro skóre konečného stádia jaterního onemocnění (MELD) v době transplantace. Po transplantaci jaterní biopsie se provádějí pouze v klinicky indikovaných případech. Akutní buněčná rejekce je diagnostikována, když jsou přítomna alespoň dvě ze tří následujících kritérií: portální mononukleární infiltrace, zánět/poškození žlučovodů a subendoteliální zánět portálních venul a/nebo terminálních jaterních venul. Závažnost odmítnutí je odstupňována na základě indexu aktivity odmítnutí takto: 0-2 = žádné odmítnutí, 3 = hraniční, 4-5 = mírné, 6-7 = střední a 8-9 = závažné91. Mírná rejekce se zpočátku léčí zvýšením dávky prografu samotného nebo v kombinaci se steroidy. Rejekce rezistentní na steroidy je po potvrzení biopsií léčena muromonabem (OKT3).
5. Plazmatický TNF-alfa, IL-6 a 8 a rozpustný L-selektin: Plazma se oddělí od systémové žilní krve odebrané 3, 12, 24, 48 hodin po reperfuzi příjemcům jater s a bez IPC a vzorky se skladují při -70 °C . Hladiny TNF-alfa, IL-6 a IL-8 a rozpustného L-selektinu se kvantifikují pomocí komerčně dostupných souprav pro imunosorbentní testy s navázaným enzymem (R & D Systems, Minneapolis, MN) v duplikátech. Testy se provádějí podle pokynů výrobce.
6. Neutrofilní CD11beta/CD18 a L-selektin, trombocytární P-selektin a trombocytární neutrofilní komplexy a oxidační vzplanutí neutrofilů v periferní krvi: Systémová žilní krev se odebírá do heparinizovaných (10 U/ml) stříkaček 3, 12, 24 a 48 hodin po reperfuze od příjemců jater s a bez IPC. Padesát mikrol krve se přidá k saturačním koncentracím monoklonálních protilátek konjugovaných s fluorescein isothiokyantem (FITC) nebo fykoerythrinem (PE) (Dako Corp, Carpenteria, CA) k CD 11beta/CD18, CD 62 L (L-selektin), CD 42 ( receptor destičkového von Willebrandova faktoru) a CD 62P (P-selektin). Po 10 minutách inkubace při teplotě místnosti se červené krvinky lyžují přidáním 200 mikroL FACSlyse (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Po 10 minutách inkubace se přidá 250 ul 0,2% formaldehydu v PBS. Vzorky jsou analyzovány průtokovou cytometrií FasCalibur (Becton Dickinson, Fair Lakes, NJ). Fluorescence FITC se měří při 515 nm a PE při 580 nm. Neutrofily se vyznačují svými snadno identifikovatelnými charakteristikami na grafu přímého a bočního rozptylu. Počítá se minimálně 5000 neutrofilních událostí. Události barvení pozitivní na CD 11beta i CD 42 jsou považovány za PNC, jak je popsáno v Peters et al72. Aby se minimalizovalo riziko identifikace jednotlivých krevních destiček a neutrofilů, protože průtok PNC je upraven tak, aby vedl k < 4500 příhod/s. Výsledky jsou považovány za pozitivní, pokud intenzita fluorescence překročí 98 % izotypově odpovídajících kontrolních protilátek. Výsledky jsou vyjádřeny jako střední intenzita fluorescence (MFI). Oxidační vzplanutí se měří využitím oxidace dihydrorhodaminu na fluorescenční rhodamin reaktivními formami kyslíku generovanými neutrofily, jak popsal Vowells et al92. Stručně, 300 mikroL heparinizované plné krve se přidá ke 4 ml pufru pro lýzu červených krvinek (37 °C). Po pěti minutách inkubace se peleta resuspenduje v HBSS obsahujícím 5 % fetálního telecího séra. Přidá se 1,8 mikroL DHR v DMSO a inkubuje se při teplotě místnosti po dobu 10 minut a poté se provede analýza průtokovou cytometrií. Jako pozitivní kontrola se používá stimulace PMA (1 mikrog/ml).
7. Plicní edém: Rentgenové snímky hrudníku se provádějí v předozadní projekci s pacientem v polovzpřímené poloze po dokončení transplantace a v pooperační dny 1, 2 a 3. Plicní edém se hodnotí podle přítomnosti nebo nepřítomnosti intersticiálního edému a alveolárního edém podle přijatých kritérií93. Radiolog je maskovaný ohledně skupinového přiřazení předmětů.