Preacondicionamiento Isquémico del Hígado en Donante Cadáver

Objetivos Específicos

1. Probar la hipótesis de que 10 minutos de preacondicionamiento isquémico hepático en donantes fallecidos mejorarían la función del injerto hepático y disminuirían las lesiones en el período postrasplante temprano.

   Para lograr este objetivo, compararemos las razones normalizadas internacionales de tiempo de protrombina (INR/PT) y aspartato sérico (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) y los niveles de bilirrubina total (TB) inmediatamente después del trasplante y en los días 1, 3, 7 y 14 and 30 y score de lesión de biopsias hepáticas por reperfusión en receptores de hígados de donantes IPC y No IPC.

2. Probar la hipótesis de que el preacondicionamiento isquémico de hígados de donantes fallecidos disminuiría la respuesta inflamatoria sistémica en los receptores de hígado en el período postrasplante temprano.

   Para lograr este objetivo, compararemos los niveles plasmáticos de las citoquinas factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-alfa), interleucinas-6, 8 y 10 (IL-6, 8 y 10) y L-selectina soluble, niveles de expresión de moléculas de adhesión (CD11beta/CD18 y L-selectina) y explosión oxidativa de neutrófilos, plaquetas P-selectina y complejos plaquetas-neutrófilos (PNC) en sangre periférica 3, 12, 24 y 48 horas después de la reperfusión en receptores de hígados de IPC y No IPC donantes

3. Examinar si el preacondicionamiento isquémico de hígados de donantes fallecidos disminuye el edema pulmonar y el rechazo agudo postrasplante y acorta la estancia hospitalaria.

Para lograr este objetivo, compararemos el edema intersticial y alveolar en las radiografías de tórax realizadas después del trasplante y en los días postoperatorios 1, 2 y 3; la biopsia confirmó el rechazo agudo dentro de los 30 días posteriores al trasplante y el número de días hasta el alta después del trasplante en receptores de hígados de donantes IPC y No IPC.

Diseño de la investigación Se llevará a cabo un estudio prospectivo, aleatorizado y enmascarado simple (receptores de hígado) en un centro de trasplante de hígado durante un período de dos años. Los donantes de hígado fallecidos se asignarán al azar en proporciones iguales a uno de dos procedimientos de recuperación de órganos: 1). CIP o 2). Sin CIP. La asignación se estratificará por edad < 50 o edad >= 50 para facilitar el examen de los efectos de la edad en la IPC. Como el ensayo reclutará donantes durante un período de dos años, las asignaciones de tratamiento se equilibrarán en bloques de 12, 16 y 20 de duración, donde la duración se seleccionará al azar, para controlar los factores variables en el tiempo. Los hígados recuperados se trasplantan a receptores mayores de 18 años. Todos los demás aspectos de la gestión de donantes, la recuperación y conservación de órganos, la selección de receptores, la implantación de injertos y la gestión posterior al trasplante, incluida la inmunosupresión, se realizarán de acuerdo con la práctica habitual.

II. Métodos de búsqueda

1. Recuperación del hígado e IPC: los donantes se colocan en decúbito supino, reciben ventilación mecánica y se les administra oxígeno al 100 % y un relajante muscular. El abdomen y el pecho se abren en la línea media. Brevemente, se dividen los ligamentos redondo y falciforme y se realiza una incisión e irrigación de la vesícula biliar. Se liga la arteria gastroduodenal y se unen las venas esplénica y mesentérica superior o, cuando se obtiene el páncreas, se prepara la vena mesentérica inferior para la canulación. La aorta supracelíaca está expuesta justo debajo del diafragma. La aorta abdominal infrarrenal se aísla para la canulación. No se realiza ninguna movilización de los riñones antes de la perfusión de órganos. Los órganos torácicos se movilizan simultáneamente o antes de la movilización de los órganos abdominales. Se administran quinientas unidades/kg de heparina por vía intravenosa y se canulan la aorta abdominal torácica ascendente e infrarrenal. Se inserta otra cánula en la vena esplénica o en la vena mesentérica inferior. Se pinza la aorta abdominal supracelíaca y se ventila la vena cava inferior en el pericardio. La solución UW (40C) se infunde en la aorta abdominal y la vena porta (2 litros cada una). La cavidad abdominal está llena de hielo granizado. Después de completar la perfusión de órganos, se extraen en secuencia el corazón, los pulmones, el hígado y el páncreas y los riñones. Los hígados se colocan en bolsas de plástico que contienen un litro de solución UW (40C) y se envasan en hielo hasta el momento del trasplante.

   El preacondicionamiento isquémico se realiza poco después de abrir el abdomen pinzando el hilio hepático con una pinza vascular durante cinco minutos, que se repite nuevamente después de cinco minutos de reperfusión. Durante la IPC, se inspecciona la cavidad peritoneal en busca de sangrado, congestión y edema del páncreas y el intestino delgado.

2. Implantación del injerto: la hepatectomía del receptor se realiza de manera estándar con conservación de la vena cava y sin utilizar un bypass venovenoso. El injerto hepático se implanta a cuestas88. El aloinjerto se reperfunde después de completar las anastomosis de la vena porta y la cava suprahepática. El injerto se lava con aproximadamente 300 ml de sangre del receptor, que se ventila a través de la vena cava infrahepática del donante, después de lo cual se liga esta estructura. Las anastomosis arteriales y de los conductos biliares se completan después de la reperfusión del injerto.
3. Biopsia hepática y lesión por reperfusión: Inmediatamente después de abrir el abdomen del donante y antes de la IPC, se realiza una biopsia con cuña y aguja del lóbulo derecho. Se realiza otra biopsia en cuña y aguja 90 minutos después de la reperfusión del receptor. La biopsia hepática después del trasplante se realiza solo cuando está clínicamente indicado. Las muestras fijadas en formalina se incluyen en parafina, se seccionan con un grosor de cinco micras y se tiñen con hematoxilina y eosina. La cantidad de grasa en las biopsias de donantes se clasifica semicuantitativamente de la siguiente manera89; Sin grasa = grado 0, 1-15 % = grado I, 16-30 % = grado II, 31-45 % = grado III, > 45 % = grado IV. La lesión por reperfusión se clasifica (de 0 a 10 en gravedad creciente) examinando 30 campos de alta potencia (600x) de cada biopsia posterior a la perfusión. Se enumeran las células apoptóticas y se asigna una puntuación semicuantitativa a la inflamación de los hepatocitos, la hemorragia en la zona 3 y la necrosis90. Se espera que las puntuaciones de reperfusión en el estudio propuesto oscilen entre 0,5 y 5 según nuestro trabajo anterior36. El patólogo está enmascarado con respecto a la asignación de grupo de todas las biopsias.
4. Inmunosupresión y Rechazo Agudo: Todos los pacientes reciben tacrolimus y esteroides para la inmunosupresión. En pacientes con síndrome hepatorrenal, el uso de tacrolimus se retrasa varios días y puede usarse a una dosis mucho más baja que el uso estándar. La inmunosupresión farmacológica se cuantificará determinando la dosis media de esteroides por día, la media de la mediana semanal del nivel de tacrolimus durante las primeras cinco semanas y la proporción de receptores en cada grupo que podrían recibir otros agentes como micofenolato y anticuerpos contra el receptor de IL-2. . La inmunosupresión causada por la insuficiencia hepática del receptor se evaluará mediante su modelo de puntuación MELD (enfermedad hepática en etapa terminal) en el momento del trasplante. Después del trasplante, las biopsias de hígado se realizan solo cuando está clínicamente indicado. El rechazo celular agudo se diagnostica cuando están presentes al menos dos de los tres criterios siguientes: infiltración mononuclear portal, inflamación/daño del conducto biliar e inflamación subendotelial de las vénulas portales y/o vénulas hepáticas terminales. La gravedad del rechazo se clasifica en función del índice de actividad del rechazo de la siguiente manera: 0-2 = sin rechazo, 3 = limítrofe, 4-5 = leve, 6-7 = moderado y 8-9 = grave91. El rechazo leve se trata inicialmente con un aumento de la dosis de prograf solo o en combinación con esteroides. El rechazo resistente a esteroides, previa confirmación con biopsia se trata con muromonab (OKT3).
5. Plasma TNF-alfa, IL-6 y 8, y L-selectina soluble: El plasma se separa de la sangre venosa sistémica extraída 3, 12, 24, 48 horas después de la reperfusión de receptores de hígados con y sin IPC y las muestras se almacenan a -700C . Los niveles de TNF-alfa, IL-6 e IL-8 y L-selectina soluble se cuantifican con kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas comercialmente disponibles (R & D Systems, Minneapolis, MN) por duplicado. Los ensayos se realizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
6. Neutrófilo CD11beta/CD18 y L-selectina, P-selectina de plaquetas y complejos de plaquetas-neutrófilos y explosión oxidativa de neutrófilos en sangre periférica: la sangre venosa sistémica se recoge en jeringas heparinizadas (10 U/ml) 3, 12, 24 y 48 horas después reperfusión de receptores de hígados con y sin IPC. Se agregan cincuenta microL de sangre a concentraciones saturadas de isotiocianato de fluoresceína (FITC), o anticuerpos monoclonales conjugados con ficoeritrina (PE) (Dako Corp, Carpenteria, CA) contra CD 11beta/CD18, CD 62 L (L-selectina), CD 42 ( receptor plaquetario del factor von Willebrand) y CD 62P (selectina P). Después de 10 min de incubación a temperatura ambiente, los glóbulos rojos se lisan mediante la adición de 200 microL de FACSlyse (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Después de 10 min de incubación se añaden 250 microL de formaldehído al 0,2% en PBS. Las muestras se analizan en una citometría de flujo FasCalibur (Becton Dickinson, Fair Lakes, NJ). La fluorescencia de FITC se mide a 515 nm y PE a 580 nm. Los neutrófilos se distinguen por sus características fácilmente identificables en el gráfico de dispersión frontal y lateral. Se cuentan un mínimo de 5000 eventos de neutrófilos. Los eventos de tinción positiva tanto para CD 11beta como para CD 42 se consideran PNC, según lo descrito por Peters et al72. Para minimizar el riesgo de identificar plaquetas y neutrófilos individuales, ya que la tasa de flujo de PNC se ajusta para dar como resultado < 4500 eventos/seg. Los resultados se consideran positivos si la intensidad de la fluorescencia supera el 98 % de los anticuerpos de control de isotipo coincidente. Los resultados se expresan como intensidad de fluorescencia mediana (MFI). El estallido oxidativo se mide mediante la utilización de la oxidación de dihidrorrodamina a rodamina fluorescente por especies reactivas de oxígeno generadas por neutrófilos, como describen Vowells et al92. Brevemente, se añaden 300 microL de sangre completa heparinizada a 4 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (370C). Después de cinco minutos de incubación, el sedimento se resuspende en HBSS que contiene suero de ternera fetal al 5%. Se añaden 1,8 microL de DHR en DMSO y se incuban a temperatura ambiente durante 10 min, seguido de un análisis de citometría de flujo. La estimulación con PMA (1 microg/ml) se usa como control positivo.
7. Edema pulmonar: Las radiografías de tórax se realizan en proyección anteroposterior con el paciente en posición semierecta al finalizar el trasplante y en los días 1, 2 y 3 del postoperatorio. El edema pulmonar se evalúa por la presencia o ausencia de edema intersticial y alveolar. edema según los criterios aceptados93. El radiólogo está enmascarado con respecto a la asignación de grupos de sujetos.