Ischämische Vorkonditionierung der Leber bei Leichenspendern

Spezifische Ziele

1. Um die Hypothese zu testen, dass eine 10-minütige hepatische ischämische Vorkonditionierung bei verstorbenen Spendern die Lebertransplantatfunktion verbessern und Verletzungen in der frühen Zeit nach der Transplantation verringern würde.

   Um dieses Ziel zu erreichen, werden wir die international normalisierten Verhältnisse der Prothrombinzeit (INR/PT) und der Serumaspartat- (AST) und Alaninaminotransferase- (ALT) und Gesamtbilirubinspiegel (TB) unmittelbar nach der Transplantation und an den Tagen 1, 3, 7 vergleichen. 14 und 30 und Verletzungsscore von Reperfusionsleberbiopsien bei Empfängern von Lebern von IPC- und Nicht-IPC-Spendern.

2. Um die Hypothese zu testen, dass eine ischämische Vorkonditionierung verstorbener Spenderleber die systemische Entzündungsreaktion bei Leberempfängern in der frühen Zeit nach der Transplantation verringern würde.

   Um dieses Ziel zu erreichen, werden wir die Plasmaspiegel der Zytokine Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-alpha), Interleukine-6, 8 und 10 (IL-6, 8 und 10) und lösliches L-Selectin sowie die Expressionsspiegel von Adhäsionsmolekülen vergleichen (CD11beta/CD18 und L-Selectin) und oxidativer Ausbruch von Neutrophilen, Thrombozyten-P-Selectin und Thrombozyten-Neutrophilen-Komplexen (PNC) im peripheren Blut 3, 12, 24 und 48 Stunden nach der Reperfusion bei Empfängern von Lebern mit IPC und ohne IPC Spender.

3. Es sollte untersucht werden, ob die ischämische Vorkonditionierung verstorbener Spenderleber das Lungenödem und die akute Abstoßung zu Beginn der Transplantation verringert und den Krankenhausaufenthalt verkürzt.

Um dieses Ziel zu erreichen, werden wir interstitielle und alveoläre Ödeme in Röntgenaufnahmen des Brustkorbs vergleichen, die nach der Transplantation und an den postoperativen Tagen 1, 2 und 3 angefertigt wurden; Die Biopsie bestätigte eine akute Abstoßung innerhalb von 30 Tagen nach der Transplantation und die Anzahl der Tage bis zur Entlassung nach der Transplantation bei Empfängern von Lebern von IPC- und Nicht-IPC-Spendern.

Forschungsdesign Eine prospektive, randomisierte und einfach maskierte Studie (Leberempfänger) wird über einen Zeitraum von zwei Jahren in einem Lebertransplantationszentrum durchgeführt. Verstorbene Leberspender werden zu gleichen Teilen randomisiert einem von zwei Organwiederherstellungsverfahren zugeteilt: 1). IPC oder 2). Kein IPC. Die Zuordnung erfolgt stratifiziert nach Alter < 50 oder Alter >= 50, um die Untersuchung der Auswirkungen des Alters auf den IPC zu erleichtern. Da in die Studie Spender über einen Zeitraum von zwei Jahren aufgenommen werden, werden die Behandlungszuweisungen auf Blöcke der Länge 12, 16 und 20 verteilt, wobei die Länge nach dem Zufallsprinzip ausgewählt wird, um zeitlich variierende Faktoren zu kontrollieren. Genesene Lebern werden an Empfänger > 18 Jahre transplantiert. Alle anderen Aspekte des Spendermanagements, der Organgewinnung und -erhaltung, der Empfängerauswahl, der Transplantatimplantation und des Posttransplantationsmanagements einschließlich der Immunsuppression erfolgen gemäß der Standardpraxis.

II. Forschungsmethoden

1. Leberwiederherstellung und IPC: Die Spender werden auf dem Rücken gelagert, mechanisch beatmet und erhalten 100 % Sauerstoff und ein Muskelrelaxans. Bauch und Brust werden in der Mittellinie geöffnet. Kurz gesagt, das runde und das falciforme Band werden durchtrennt und die Gallenblase wird eingeschnitten und gespült. Die gastroduodenale Arterie wird ligiert und die Verbindung zwischen Milzvene und oberer Mesenterialvene hergestellt. Bei der Gewinnung von Bauchspeicheldrüse wird die untere Mesenterialvene für die Kanülierung vorbereitet. Die supraceliakale Aorta liegt knapp unterhalb des Zwerchfells frei. Zur Kanülierung wird die infrarenale Bauchaorta isoliert. Vor der Organperfusion erfolgt keine Mobilisierung der Nieren. Brustorgane werden entweder gleichzeitig oder vor der Mobilisierung der Bauchorgane mobilisiert. Fünfhundert Einheiten/kg Heparin werden intravenös verabreicht und die aufsteigende Brustaorta und die infrarenale Bauchaorta werden kanüliert. Eine weitere Kanüle wird entweder in die Milzvene oder die untere Mesenterialvene eingeführt. Die supraceliakale Bauchaorta wird abgeklemmt und die Vena cava inferior im Perikard entlüftet. UW-Lösung (40 °C) wird in die Bauchaorta und die Pfortader infundiert (jeweils 2 Liter). Die Bauchhöhle ist mit Eisbrei gefüllt. Nach Abschluss der Organperfusion werden nacheinander Herz, Lunge, Leber sowie Bauchspeicheldrüse und Nieren entfernt. Die Lebern werden in Plastikbeutel mit einem Liter UW-Lösung (40 °C) gegeben und bis zum Zeitpunkt der Transplantation in Eis gepackt.

   Die ischämische Vorkonditionierung wird kurz nach der Öffnung des Abdomens durchgeführt, indem der Leberhilus fünf Minuten lang mit einer Gefäßklemme abgeklemmt wird, was nach fünf Minuten Reperfusion erneut wiederholt wird. Bei der IPC wird die Bauchhöhle auf Blutungen, Stauungen und Ödeme der Bauchspeicheldrüse und des Dünndarms untersucht.

2. Transplantatimplantation: Die Hepatektomie des Empfängers erfolgt standardmäßig unter Kavalerhaltung und ohne Verwendung eines venovenösen Bypasses. Das Lebertransplantat wird huckepack implantiert88. Nach Abschluss der suprahepatischen Caval- und Pfortaderanastomosen wird das Allotransplantat erneut perfundiert. Das Transplantat wird mit etwa 300 ml Empfängerblut gespült, das über die infrahepatische Hohlvene des Spenders abgelassen wird. Anschließend wird diese Struktur abgebunden. Die Anastomosen der Arterien und des Gallengangs sind nach der Reperfusion des Transplantats abgeschlossen.
3. Leberbiopsie und Reperfusionsverletzung: Eine Keil- und Nadelbiopsie des rechten Leberlappens wird unmittelbar nach der Öffnung des Bauches des Spenders und vor der IPC durchgeführt. Eine weitere Keil- und Nadelbiopsie wird 90 Minuten nach der Reperfusion des Empfängers durchgeführt. Eine Leberbiopsie nach einer Transplantation wird nur bei klinischer Indikation durchgeführt. Mit Formalin fixierte Proben werden in Paraffin eingebettet, in fünf Mikrometer dünne Schnitte geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Die Fettmenge in Spenderbiopsien wird halbquantitativ wie folgt bewertet89; Kein Fett = Grad 0, 1–15 % = Grad I, 16–30 % = Grad II, 31–45 % = Grad III, > 45 % = Grad IV. Die Reperfusionsverletzung wird durch die Untersuchung von 30 Hochleistungsfeldern (600x) jeder Post-Perfusionsbiopsie eingestuft (0-10 mit zunehmendem Schweregrad). Apoptotische Zellen werden gezählt und Hepatozytenschwellungen, Zone-3-Blutungen und Nekrosen werden einem semiquantitativen Score zugewiesen90. Die Reperfusionswerte in der vorgeschlagenen Studie werden basierend auf unserer bisherigen Arbeit voraussichtlich zwischen 0,5 und 5 liegen36. Der Pathologe ist bezüglich der Gruppenzuordnung aller Biopsien maskiert.
4. Immunsuppression und akute Abstoßung: Alle Patienten erhalten Tacrolimus und Steroide zur Immunsuppression. Bei Patienten mit hepatorenalem Syndrom wird die Anwendung von Tacrolimus um mehrere Tage verzögert und kann in einer viel niedrigeren Dosis als bei der Standardanwendung erfolgen. Die pharmakologische Immunsuppression wird quantifiziert, indem die mittlere Steroiddosis pro Tag, der Mittelwert des wöchentlichen mittleren Tacrolimus-Spiegels für die ersten fünf Wochen und der Anteil der Empfänger in jeder Gruppe bestimmt werden, die möglicherweise andere Wirkstoffe wie Mycophenolat und IL-2-Rezeptor-Antikörper erhalten . Die durch Leberversagen des Empfängers verursachte Immunsuppression wird anhand ihres Modells für den Endstadium-Lebererkrankungs-Score (MELD) zum Zeitpunkt der Transplantation bewertet. Nach einer Transplantation werden Leberbiopsien nur bei klinischer Indikation durchgeführt. Eine akute Zellabstoßung wird diagnostiziert, wenn mindestens zwei der drei folgenden Kriterien vorliegen: portale mononukleäre Infiltration, Entzündung/Schädigung des Gallengangs und subendotheliale Entzündung der Pfortadervenolen und/oder terminalen Lebervenolen. Der Schweregrad der Abstoßung wird anhand des Abstoßungsaktivitätsindex wie folgt bewertet: 0–2 = keine Abstoßung, 3 = grenzwertig, 4–5 = leicht, 6–7 = mäßig und 8–9 = schwer91. Eine leichte Abstoßung wird zunächst mit einer Erhöhung der Prograf-Dosis allein oder in Kombination mit Steroiden behandelt. Eine steroidresistente Abstoßung wird nach Bestätigung durch eine Biopsie mit Muromonab (OKT3) behandelt.
5. Plasma-TNF-alpha, IL-6 und 8 und lösliches L-Selectin: Das Plasma wird vom systemischen venösen Blut abgetrennt, das 3, 12, 24, 48 Stunden nach der Reperfusion von Empfängern von Lebern mit und ohne IPC entnommen wird, und die Proben werden bei -70 °C gelagert . Die Konzentrationen von TNF-alpha, IL-6 und IL-8 sowie löslichem L-Selectin werden mit kommerziell erhältlichen Enzymimmunoassay-Kits (R & D Systems, Minneapolis, MN) in Duplikaten quantifiziert. Die Tests werden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
6. Neutrophiles CD11beta/CD18 und L-Selectin, Thrombozyten-P-Selectin und Thrombozyten-Neutrophilen-Komplexe sowie oxidativer Ausbruch von Neutrophilen im peripheren Blut: Systemisches venöses Blut wird 3, 12, 24 und 48 Stunden danach in heparinisierten (10 U/ml) Spritzen gesammelt Reperfusion von Leberempfängern mit und ohne IPC. Fünfzig Mikroliter Blut werden zu sättigenden Konzentrationen von Fluoresceinisothiocyant (FITC) oder Phycoerythrin (PE) konjugierten monoklonalen Antikörpern (Dako Corp, Carpenteria, CA) gegen CD 11beta/CD18, CD 62 L (L-Selectin), CD 42 ( Thrombozyten-von-Willebrand-Faktor-Rezeptor) und CD 62P (P-Selectin). Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur werden die roten Blutkörperchen durch Zugabe von 200 Mikroliter FACSlyse (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) lysiert. Nach 10-minütiger Inkubation werden 250 Mikroliter 0,2 % Formaldehyd in PBS hinzugefügt. Die Proben werden in einer FasCalibur-Durchflusszytometrie (Becton Dickinson, Fair Lakes, NJ) analysiert. Die Fluoreszenz von FITC wird bei 515 nm und die von PE bei 580 nm gemessen. Neutrophile zeichnen sich durch ihre leicht erkennbaren Merkmale im Vorwärts- und Seitenstreudiagramm aus. Es werden mindestens 5000 neutrophile Ereignisse gezählt. Ereignisse, die sowohl für CD 11beta als auch für CD 42 positiv gefärbt sind, gelten als PNC, wie von Peters et al72 beschrieben. Um das Risiko der Identifizierung einzelner Blutplättchen und Neutrophilen zu minimieren, wird die PNC-Flussrate so angepasst, dass sie zu < 4500 Ereignissen/Sek. führt. Die Ergebnisse gelten als positiv, wenn die Fluoreszenzintensität 98 % der isotypangepassten Kontrollantikörper übersteigt. Die Ergebnisse werden als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ausgedrückt. Der oxidative Ausbruch wird anhand der Oxidation von Dihydrorhodamin zu fluoreszierendem Rhodamin durch durch Neutrophile erzeugte reaktive Sauerstoffspezies gemessen, wie von Vowells et al.92 beschrieben. Kurz gesagt, 300 Mikroliter heparinisiertes Vollblut werden zu 4 ml Erythrozyten-Lysepuffer (370 °C) gegeben. Nach fünfminütiger Inkubation wird das Pellet in HBSS, das 5 % fötales Kälberserum enthält, resuspendiert. 1,8 Mikroliter DHR in DMSO werden hinzugefügt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einer durchflusszytometrischen Analyse. Als Positivkontrolle dient die Stimulation mit PMA (1 Mikrogramm/ml).
7. Lungenödem: Nach Abschluss der Transplantation und an den postoperativen Tagen 1, 2 und 3 werden Röntgenaufnahmen des Brustkorbs in einer antero-posterioren Projektion durchgeführt, wobei sich der Patient in halbaufrechter Position befindet. Lungenödeme werden anhand des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins interstitieller Ödeme und Alveolarödeme beurteilt Ödem gemäß anerkannten Kriterien93. Der Radiologe ist hinsichtlich der Gruppenzuordnung der Probanden maskiert.