Iskæmisk prækonditionering af lever hos kadaverdonorer

Specifikke mål

1. For at teste hypotesen om, at 10 minutters leveriskæmisk prækonditionering hos afdøde donorer ville forbedre levertransplantatfunktionen og mindske skaden i den tidlige posttransplantationsperiode.

   For at nå dette mål vil vi sammenligne internationale normaliserede forhold mellem protrombintid (INR/PT) og serumaspartat (AST) og alaninaminotransferase (ALT) og total bilirubin (TB) niveauer umiddelbart efter transplantationen og på dag 1, 3, 7, 14 og 30 og skadescore af reperfusionsleverbiopsier hos modtagere af lever fra IPC og ingen IPC-donorer.

2. For at teste hypotesen om, at iskæmisk prækonditionering af afdøde donorlevere ville mindske det systemiske inflammatoriske respons hos levermodtagere i den tidlige post-transplantationsperiode.

   For at nå dette mål vil vi sammenligne plasmaniveauer af cytokiner tumornekrosefaktor-alfa (TNF-alfa), interleukiner-6, 8 og 10 (IL-6, 8 og 10) og opløseligt L-selektin, ekspressionsniveauer af adhæsionsmolekyler (CD11beta/CD18 og L-selectin) og oxidativt udbrud af neutrofiler, blodplade-P-selektin og blodplade-neutrofilkomplekser (PNC) i det perifere blod 3, 12, 24 og 48 timer efter reperfusion hos modtagere af lever fra IPC og No IPC donorer.

3. At undersøge om iskæmisk prækonditionering af afdøde donorlever nedsætter lungeødem tidligt efter transplantation og akut afstødning og forkorter hospitalsophold.

For at nå dette mål vil vi sammenligne interstitielt og alveolært ødem i røntgenbilleder af brystet efter transplantation og på postoperative dag 1, 2 og 3; biopsi bekræftede akut afstødning inden for 30 dage efter transplantation og antal dage til udskrivning efter transplantation hos modtagere af lever fra IPC og ingen IPC-donorer.

Forskningsdesign En prospektiv, randomiseret og enkeltmasket (levermodtagere) undersøgelse vil blive udført i et levertransplantationscenter over en periode på to år. Afdøde leverdonorer vil blive randomiseret i lige store forhold til en af ​​to organgendannelsesprocedurer: 1). IPC eller 2). Ingen IPC. Tildelingen vil blive stratificeret efter alder < 50 eller alder >= 50 for at lette undersøgelse af alders indvirkning på IPC. Da forsøget vil indskrive donorer over en toårig periode, vil behandlingstildelinger blive afbalanceret over blokke af længde 12, 16 og 20, hvor længden vil blive udvalgt tilfældigt for at kontrollere for tidsvarierende faktorer. Genvundne lever transplanteres til modtagere > 18 år. Alle andre aspekter af donorhåndtering, organgenvinding og -bevaring, recipientudvælgelse, implantation af transplantater og posttransplantation, herunder immunsuppression, vil være i overensstemmelse med standardpraksis.

II. Forskningsmetoder

1. Levergendannelse og IPC: Donorer placeres på ryggen, mekanisk ventileret og administreres 100 % oxygen og et muskelafslappende middel. Maven og brystet åbnes i midterlinjen. Kort fortalt deles runde og falciforme ledbånd, og galdeblæren snittes og skylles. Den gastroduodenale arterie er ligeret, og forbindelsen mellem milten og mesenteriske vener superior eller, når bugspytkirtlen er fremskaffet, er den inferior mesenteriske vene forberedt til kanulering. Den supraceliac aorta er blotlagt lige under mellemgulvet. Den infrarenale abdominale aorta er isoleret til kanulering. Ingen mobilisering af nyrerne udføres før organperfusion. Thoraxorganer mobiliseres enten samtidigt eller før mobilisering af abdominale organer. Fem hundrede enheder/kg heparin gives intravenøst, og ascendens thorax og infrarenal abdominal aorta kanuleres. En anden kanyle indsættes enten i miltvenen eller den nedre mesenteriske vene. Den supraceliac abdominale aorta fastklemmes, og vena cava inferior udluftes i hjertesækken. UW-opløsning (40C) infunderes i abdominal aorta og portvenen (2 liter hver). Bughulen er pakket med isslam. Efter afslutning af organperfusion fjernes hjerte, lunger, lever og bugspytkirtel og nyrer i rækkefølge. Lever placeres i plastikposer indeholdende en liter UW-opløsning (40C) og pakkes i is indtil transplantationstidspunktet.

   Iskæmisk prækonditionering udføres kort efter åbning af abdomen ved at klemme hepatiske hilum med en vaskulær klemme i fem minutter, som gentages igen efter fem minutters reperfusion. Under IPC inspiceres bughulen for blødning, overbelastning og ødem i bugspytkirtlen og tyndtarmen.

2. Graftimplantation: Recipienthepatektomi udføres på en standard måde med kavalebevaring og uden brug af venovenøs bypass. Levertransplantatet implanteres på en piggyback-måde88. Allotransplantatet reperfunderes efter afslutning af den suprahepatiske kavale og portvene-anastomoser. Graftet skylles med ca. 300 ml modtagerblod, som udluftes via donorens infrahepatiske vena cava, hvorefter denne struktur ligeres. Arteriel og galdegangsanastomoser afsluttes efter graft-reperfusion.
3. Leverbiopsi og reperfusionsskade: En kile- og en nålebiopsi af højre lap udføres umiddelbart efter åbning af donorens mave og før IPC. Endnu en kile- og nålebiopsi udføres 90 minutter efter modtagerens reperfusion. Leverbiopsi efter transplantation udføres kun, når det er klinisk indiceret. Formalinfikserede prøver er indlejret i paraffin, sektioneret fem mikrometer tynde og farvet med hæmatoxylin og eosin. Mængden af ​​fedt i donorbiopsier er klassificeret semikvantitativt som følger89; Intet fedt = grad 0, 1-15% = grad I, 16-30% = grad II, 31-45% = grad III, > 45% = grad IV. Reperfusionsskade graderes (0-10 i stigende sværhedsgrad) ved at undersøge 30 højeffektfelter (600x) af hver postperfusionsbiopsi. Apoptotiske celler optælles, og hepatocythævelse, zone 3-blødning og nekrose tildeles en semikvantitativ score90. Reperfusionsscorerne i den foreslåede undersøgelse forventes at ligge mellem 0,5 og 5 baseret på vores tidligere arbejde36. Patologen er maskeret mht. gruppetildelingen af ​​alle biopsier.
4. Immunsuppression og akut afstødning: Alle patienter får tacrolimus og steroider til immunsuppression. Hos patienter med hepatorenalt syndrom er brugen af ​​tacrolimus forsinket i flere dage og kan anvendes i en meget lavere dosis end standardbrugen. Farmakologisk immunsuppression vil blive kvantificeret ved at bestemme den gennemsnitlige dosis af steroid pr. dag, middelværdien af ​​det ugentlige mediane tacrolimusniveau i de første fem uger og andelen af ​​modtagere i hver gruppe, der kan modtage andre midler såsom mycophenolat og IL-2-receptorantistof . Immunsuppression forårsaget af modtagers leversvigt vil blive vurderet af deres model for slutstadie leversygdom (MELD) score på tidspunktet for transplantation. Efter transplantation udføres leverbiopsier kun, når det er klinisk indiceret. Akut cellulær afstødning diagnosticeres, når mindst to af de tre følgende kriterier er til stede: portalmononukleær infiltration, galdevejsinflammation/-beskadigelse og subendotelinflammation af portalvenulerne og/eller terminale hepatiske venoler. Sværhedsgraden af ​​afvisningen er graderet baseret på afvisningsaktivitetsindekset som følger: 0-2 = ingen afvisning, 3 = grænseoverskridende, 4-5 = mild, 6-7 = moderat og 8-9 = svær91. Mild afstødning behandles initialt med eskalering af prografdosis alene eller i kombination med steroider. Steroidresistent afstødning, efter bekræftelse med biopsi behandles med muromonab (OKT3).
5. Plasma TNF-alfa, IL-6 og 8, og opløseligt L-selectin: Plasma adskilles fra systemisk venøst ​​blod taget 3, 12, 24, 48 timer efter reperfusion fra modtagere af lever med og uden IPC, og prøver opbevares ved -700C . Niveauer af TNF-alfa, IL-6 og IL-8 og opløseligt L-selectin kvantificeres med kommercielt tilgængelige enzym-koblede immunosorbent assay-kits (R&D Systems, Minneapolis, MN) i duplikater. Analyserne udføres i henhold til producentens instruktioner.
6. Neutrofil CD11beta/CD18 og L-selektin, blodplade P-selektin og blodplade-neutrofil komplekser og oxidativt udbrud af neutrofiler i perifert blod: Systemisk venøst ​​blod opsamles i hepariniserede (10 U/ml) sprøjter 3, 12, 24 og 48 timer efter reperfusion fra modtagere af lever med og uden IPC. Halvtreds mikroL blod tilsættes til mættende koncentrationer af fluorescein isothiocyante (FITC) eller phycoerythrin (PE) konjugerede monoklonale antistoffer (Dako Corp, Carpenteria, CA) til CD 11beta/CD18, CD 62 L (L-selectin), CD 42 ( blodplade von Willebrand faktor receptor) og CD 62P (P-selectin). Efter 10 minutters inkubation ved stuetemperatur lyseres røde blodlegemer ved tilsætning af 200 mikroL FACSlyse (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Efter 10 minutters inkubation tilsættes 250 mikroL 0,2% formaldehyd i PBS. Prøver analyseres i en FasCalibur flowcytometri (Becton Dickinson, Fair Lakes, NJ). Fluorescens af FITC måles ved 515 nm og PE ved 580 nm. Neutrofiler er kendetegnet ved deres let identificerbare karakteristika på fremad- og sidespredningsplot. Der tælles minimum 5000 neutrofile hændelser. Hændelser, der farves positivt for både CD 11beta og CD 42, anses for at være PNC som beskrevet af Peters et al.72. For at minimere risikoen for at identificere individuelle blodplader og neutrofiler, er PNC-flowhastigheden justeret til at resultere i < 4500 hændelser/sek. Resultater betragtes som positive, hvis fluorescensintensiteten overstiger 98 % af isotypematchede kontrolantistoffer. Resultater er udtrykt som median fluorescensintensitet (MFI). Oxidativt udbrud måles ved anvendelse af oxidation af dihydrorhodamin til fluorescerende rhodamin af neutrofilgenererede reaktive oxygenarter som beskrevet af Vowells et al.92. Kort fortalt sættes 300 mikroL hepariniseret fuldblod til 4 ml lyseringsbuffer for røde blodlegemer (37°C). Efter fem minutters inkubation resuspenderes pelleten i HBSS indeholdende 5% føtalt kalveserum. 1,8 mikroL DHR i DMSO tilsættes og inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter efterfulgt af flowcytometrisk analyse. Stimulering med PMA (1 mikrog/ml) bruges som positiv kontrol.
7. Lungeødem: Røntgenbilleder af thorax udføres i en antero-posterior projektion med patienten i semi-oprejst stilling efter afslutning af transplantationen og på postoperative dag 1, 2 og 3. Lungeødem vurderes ved tilstedeværelse eller fravær af interstitielt ødem og alveolært ødem. ødem i henhold til accepterede kriterier93. Radiologen er maskeret mht. gruppetildeling af fag.