Precondizionamento ischemico del fegato nei donatori da cadavere

Obiettivi specifici

1. Testare l'ipotesi che 10 minuti di precondizionamento ischemico epatico in donatori deceduti migliorerebbero la funzione del trapianto di fegato e ridurrebbero il danno nel primo periodo post-trapianto.

   Per raggiungere questo obiettivo, confronteremo i rapporti normalizzati internazionali del tempo di protrombina (INR/PT) e dei livelli sierici di aspartato (AST) e alanina aminotransferasi (ALT) e bilirubina totale (TB) immediatamente dopo il trapianto e nei giorni 1, 3, 7, 14 e 30 e punteggio di lesione delle biopsie epatiche di riperfusione in riceventi di fegati da donatori IPC e No IPC.

2. Testare l'ipotesi che il precondizionamento ischemico dei fegati di donatori deceduti diminuirebbe la risposta infiammatoria sistemica nei riceventi di fegato nel primo periodo post-trapianto.

   Per raggiungere questo obiettivo, confronteremo i livelli plasmatici delle citochine fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-alfa), interleuchine-6, 8 e 10 (IL-6, 8 e 10) e L-selectina solubile, livelli di espressione delle molecole di adesione (CD11beta/CD18 e L-selectina) e burst ossidativo di neutrofili, P-selectina piastrinica e complessi neutrofili piastrinici (PNC) nel sangue periferico 3, 12, 24 e 48 ore dopo la riperfusione in riceventi di fegati da IPC e No IPC donatori.

3. Esaminare se il precondizionamento ischemico dei fegati di donatori deceduti riduce l'edema polmonare e il rigetto acuto post-trapianto precoce e accorcia la degenza ospedaliera.

Per raggiungere questo obiettivo, confronteremo l'edema interstiziale e alveolare nelle radiografie del torace eseguite dopo il trapianto e nei giorni postoperatori 1, 2 e 3; la biopsia ha confermato il rigetto acuto entro 30 giorni dal trapianto e il numero di giorni alla dimissione dopo il trapianto nei riceventi di fegati da donatori IPC e No IPC.

Disegno della ricerca Uno studio prospettico, randomizzato e in maschera singola (ricevitori di fegato) sarà condotto in un centro di trapianto di fegato per un periodo di due anni. I donatori di fegato deceduti saranno randomizzati in proporzioni uguali a una delle due procedure di recupero degli organi: 1). PCI o 2). Nessun IPC. L'assegnazione sarà stratificata per età < 50 o età >= 50 per facilitare l'esame degli effetti dell'età sull'IPC. Poiché lo studio arruolerà i donatori per un periodo di due anni, le assegnazioni del trattamento saranno bilanciate su blocchi di lunghezza 12, 16 e 20, in cui la durata sarà selezionata a caso, per controllare i fattori variabili nel tempo. I fegati recuperati vengono trapiantati in riceventi > 18 anni di età. Tutti gli altri aspetti della gestione del donatore, del recupero e della conservazione dell'organo, della selezione del ricevente, dell'impianto dell'innesto e della gestione post-trapianto, inclusa l'immunosoppressione, saranno conformi alla pratica standard.

II. Metodi di ricerca

1. Recupero epatico e IPC: i donatori sono posizionati supini, ventilati meccanicamente e somministrati ossigeno al 100% e un miorilassante. L'addome e il torace sono aperti sulla linea mediana. In breve, i legamenti rotondi e falciformi vengono sezionati e la cistifellea viene incisa e irrigata. L'arteria gastroduodenale viene legata e giunzione delle vene splenica e mesenterica superiore oppure, quando viene prelevato il pancreas, viene preparata la vena mesenterica inferiore per la canulazione. L'aorta sopraceliaca è esposta appena sotto il diaframma. L'aorta addominale infrarenale viene isolata per la canulazione. Nessuna mobilizzazione dei reni viene eseguita prima della perfusione degli organi. Gli organi toracici vengono mobilizzati simultaneamente o prima della mobilizzazione degli organi addominali. Cinquecento unità/kg di eparina vengono somministrate per via endovenosa e l'aorta toracica ascendente e l'aorta addominale infrarenale vengono cannulate. Un'altra cannula viene inserita nella vena splenica o nella vena mesenterica inferiore. L'aorta addominale sopraceliaca è clampata e la vena cava inferiore è ventilata nel pericardio. La soluzione UW (40°C) viene infusa nell'aorta addominale e nella vena porta (2 litri ciascuna). La cavità addominale è piena di granita di ghiaccio. Dopo il completamento della perfusione degli organi, cuore, polmoni, fegato, pancreas e reni vengono rimossi in sequenza. I fegati vengono posti in sacchetti di plastica contenenti un litro di soluzione UW (40°C) e confezionati in ghiaccio fino al momento del trapianto.

   Il precondizionamento ischemico viene eseguito subito dopo l'apertura dell'addome bloccando l'ilo epatico con un morsetto vascolare per cinque minuti, che viene ripetuto nuovamente dopo cinque minuti di riperfusione. Durante l'IPC la cavità peritoneale viene ispezionata per sanguinamento, congestione ed edema del pancreas e dell'intestino tenue.

2. Impianto dell'innesto: l'epatectomia del ricevente viene eseguita in modo standard con conservazione della cava e senza l'utilizzo di bypass veno-venoso. L'innesto di fegato viene impiantato in modo piggyback88. L'allotrapianto viene riperfuso dopo il completamento delle anastomosi della vena porta e della cava sopraepatica. L'innesto viene lavato con circa 300 ml di sangue ricevente, che viene scaricato attraverso la vena cava infraepatica del donatore, dopodiché questa struttura viene legata. Le anastomosi arteriose e del dotto biliare sono completate dopo la riperfusione dell'innesto.
3. Biopsia epatica e lesione da riperfusione: una biopsia con cuneo e ago del lobo destro viene eseguita immediatamente dopo l'apertura dell'addome del donatore e prima dell'IPC. Un'altra biopsia con cuneo e ago viene eseguita 90 minuti dopo la riperfusione del ricevente. La biopsia epatica dopo il trapianto viene eseguita solo quando clinicamente indicato. I campioni fissati in formalina sono inclusi in paraffina, sezionati con uno spessore di cinque micron e colorati con ematossilina ed eosina. La quantità di grasso nelle biopsie del donatore è classificata semi-quantitativamente come segue89; Senza grassi = grado 0, 1-15% = grado I, 16-30% = grado II, 31-45% = grado III, > 45% = grado IV. La lesione da riperfusione viene classificata (0-10 in gravità crescente) esaminando 30 campi ad alta potenza (600x) di ciascuna biopsia post-perfusione. Vengono enumerate le cellule apoptotiche e viene assegnato un punteggio semi-quantitativo al rigonfiamento degli epatociti, all'emorragia di zona 3 e alla necrosi90. I punteggi di riperfusione nello studio proposto dovrebbero variare da 0,5 a 5 in base al nostro lavoro precedente36. Il patologo è mascherato per quanto riguarda l'assegnazione di gruppo di tutte le biopsie.
4. Immunosoppressione e rigetto acuto: tutti i pazienti ricevono tacrolimus e steroidi per l'immunosoppressione. Nei pazienti con sindrome epatorenale l'uso di tacrolimus è ritardato di diversi giorni e può essere utilizzato a una dose molto più bassa rispetto all'uso standard. L'immunosoppressione farmacologica sarà quantificata determinando la dose media di steroidi al giorno, la media del livello mediano settimanale di tacrolimus per le prime cinque settimane e la proporzione di riceventi in ciascun gruppo che potrebbero ricevere altri agenti come il micofenolato e l'anticorpo del recettore IL-2 . L'immunosoppressione causata dall'insufficienza epatica del ricevente sarà valutata dal loro modello per il punteggio della malattia epatica allo stadio terminale (MELD) al momento del trapianto. Dopo il trapianto le biopsie epatiche vengono eseguite solo quando clinicamente indicato. Il rigetto cellulare acuto viene diagnosticato quando sono presenti almeno due dei tre seguenti criteri: infiltrazione portale mononucleare, infiammazione/danno del dotto biliare e infiammazione subendoteliale delle venule portali e/o delle venule epatiche terminali. La gravità del rifiuto è classificata in base all'indice di attività di rifiuto come segue: 0-2 = nessun rifiuto, 3 = borderline, 4-5 = lieve, 6-7 = moderato e 8-9 = grave91. Il rigetto lieve viene trattato inizialmente con un aumento della dose di prograf da solo o in combinazione con steroidi. Il rigetto resistente agli steroidi, dopo la conferma con una biopsia viene trattato con muromonab (OKT3).
5. Plasma TNF-alfa, IL-6 e 8 e L-selectina solubile: il plasma viene separato dal sangue venoso sistemico prelevato 3, 12, 24, 48 ore dopo la riperfusione da riceventi di fegati con e senza IPC e i campioni vengono conservati a -70°C . I livelli di TNF-alfa, IL-6 e IL-8 e di L-selectina solubile sono quantificati con kit di test immunosorbenti legati agli enzimi disponibili in commercio (R & D Systems, Minneapolis, MN) in duplicato. I test vengono eseguiti secondo le istruzioni del produttore.
6. Neutrofili CD11beta/CD18 e L-selectina, piastrine P-selettina e complessi piastrine-neutrofili e burst ossidativo di neutrofili nel sangue periferico: il sangue venoso sistemico viene raccolto in siringhe eparinizzate (10 U/ml) 3, 12, 24 e 48 ore dopo riperfusione da riceventi di fegati con e senza IPC. Cinquanta microL di sangue vengono aggiunti a concentrazioni saturanti di anticorpi monoclonali coniugati con isotiociante di fluoresceina (FITC) o ficoeritrina (PE) (Dako Corp, Carpenteria, CA) a CD 11beta/CD18, CD 62 L (L-selectina), CD 42 ( recettore del fattore von Willebrand piastrinico) e CD 62P (P-selectina). Dopo 10 minuti di incubazione a temperatura ambiente, i globuli rossi vengono lisati mediante l'aggiunta di 200 microL di FACSlyse (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Dopo 10 min di incubazione si aggiungono 250 microL di formaldeide allo 0,2% in PBS. I campioni vengono analizzati in una citometria a flusso FasCalibur (Becton Dickinson, Fair Lakes, NJ). La fluorescenza di FITC è misurata a 515 nm e PE a 580 nm. I neutrofili si distinguono per le loro caratteristiche facilmente identificabili sul grafico a dispersione in avanti e laterale. Vengono contati almeno 5000 eventi neutrofili. Gli eventi con colorazione positiva sia per CD 11beta che per CD 42 sono considerati PNC come descritto da Peters et al72. Per ridurre al minimo il rischio di identificare singole piastrine e neutrofili, la portata del PNC viene regolata in modo da ottenere < 4500 eventi/sec. I risultati sono considerati positivi se l'intensità della fluorescenza supera il 98% degli anticorpi di controllo corrispondenti all'isotipo. I risultati sono espressi come intensità di fluorescenza mediana (MFI). Il burst ossidativo viene misurato mediante l'utilizzo dell'ossidazione della diidrorodamina a rodamina fluorescente da parte di specie reattive dell'ossigeno generate dai neutrofili, come descritto da Vowells et al92. In breve, 300 microL di sangue intero eparinizzato vengono aggiunti a 4 ml di tampone di lisi eritrocitaria (370C). Dopo cinque minuti di incubazione il pellet viene risospeso in HBSS contenente il 5% di siero di vitello fetale. 1,8 microL di DHR in DMSO vengono aggiunti e incubati a temperatura ambiente per 10 minuti seguiti dall'analisi citofluorimetrica. La stimolazione con PMA (1 microg/ml) viene utilizzata come controllo positivo.
7. Edema polmonare: le radiografie del torace vengono eseguite in proiezione antero-posteriore con il paziente in posizione semi-eretta al termine del trapianto e nei giorni 1, 2 e 3 postoperatori. L'edema polmonare viene valutato dalla presenza o assenza di edema interstiziale e alveolare edema secondo i criteri accettati93. Il radiologo è mascherato per quanto riguarda l'assegnazione di gruppo dei soggetti.