尸体捐献者肝脏的缺血预处理

具体目标

1. 检验这样一个假设，即对已故供体进行 10 分钟的肝脏缺血预处理会改善肝移植物的功能并减少移植后早期的损伤。

   为实现这一目标，我们将比较移植后即刻和第 1、3、7 天的凝血酶原时间 (INR/PT) 和血清天冬氨酸 (AST) 和丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 以及总胆红素 (TB) 水平的国际标准化比率， 14 和 30，以及来自 IPC 和无 IPC 供体的肝脏接受者的再灌注肝活检损伤评分。

2. 检验死者供体肝脏的缺血预处理会在移植后早期降低肝脏受体的全身炎症反应的假设。

   为了实现这一目标，我们将比较细胞因子肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素 6、8 和 10（IL-6、8 和 10）和可溶性 L-选择素的血浆水平，粘附分子的表达水平IPC 和无 IPC 肝脏再灌注后 3、12、24 和 48 小时外周血中中性粒细胞、血小板 P-选择素和血小板-中性粒细胞复合物 (PNC) 的（CD11beta/CD18 和 L-选择素）和氧化爆发捐助者。

3. 检查已故供体肝脏的缺血预处理是否减少移植后早期肺水肿和急性排斥反应并缩短住院时间。

为了实现这一目标，我们将比较移植后和术后第 1、2 和 3 天胸片中的间质和肺泡水肿；活组织检查证实了移植后 30 天内的急性排斥反应，以及来自 IPC 和无 IPC 供体的肝脏接受者在移植后出院的天数。

研究设计 一项为期两年的前瞻性、随机和单盲（肝脏接受者）研究将在一个肝脏移植中心进行。 已故肝脏捐献者将按相等比例随机分配到以下两个器官恢复程序之一：1)。 IPC 或 2). 没有 IPC。 分配将按年龄 < 50 或年龄 >= 50 进行分层，以便于检查年龄对 IPC 的影响。 由于该试验将在两年内招募捐赠者，因此治疗分配将在长度为 12、16 和 20 的块上进行平衡，其中长度将随机选择，以控制随时间变化的因素。 回收的肝脏被移植到 18 岁以上的接受者中。 供体管理、器官恢复和保存、受体选择、移植物植入和移植后管理（包括免疫抑制）的所有其他方面都将按照标准做法进行。

二。研究方法

1. 肝脏恢复和 IPC：供体仰卧，机械通气并给予 100% 氧气和肌肉松弛剂。 腹部和胸部在中线打开。 简而言之，切开圆韧带和镰状韧带，切开胆囊并冲洗。 结扎胃十二指肠动脉并连接脾静脉和肠系膜上静脉，或者，当获得胰腺时，肠系膜下静脉准备插管。 腹上主动脉暴露在隔膜正下方。 肾下腹主动脉被隔离用于插管。 在器官灌注之前不进行肾脏动员。 胸部器官在腹部器官动员的同时或之前动员。 静脉内给予 500 单位/kg 的肝素，并在升胸主动脉和肾下腹主动脉上插管。 将另一个插管插入脾静脉或肠系膜下静脉。 腹主动脉上腹主动脉被夹住，下腔静脉在心包中排出。 将 UW 溶液 (40C) 注入腹主动脉和门静脉（各 2 升）。 腹腔里塞满了冰泥。 器官灌注完成后，依次取出心脏、肺、肝脏和胰脏和肾脏。 将肝脏置于装有一升 UW 溶液 (40°C) 的塑料袋中，并在冰中包装直至移植。

   打开腹部后立即进行缺血预处理，用血管钳夹住肝门 5 分钟，再灌注 5 分钟后再次重复。 在 IPC 期间，检查腹膜腔是否有胰腺和小肠的出血、充血和水肿。

2. 移植物植入：受体肝切除术以标准方式完成，保留腔静脉且不使用静脉旁路。 肝移植物以背驮方式植入 88。 同种异体移植物在肝上腔静脉和门静脉吻合完成后进行再灌注。 移植物用大约 300 毫升的受体血液冲洗，通过供体的肝下腔静脉排出，然后结扎该结构。 移植物再灌注后完成动脉和胆管吻合。
3. 肝活检和再灌注损伤：在打开供体的腹部并在 IPC 之前立即对右叶进行楔形和穿刺活检。 接受者再灌注后 90 分钟进行另一次楔形穿刺活检。 移植后的肝活检仅在有临床指征时进行。 将福尔马林固定的标本包埋在石蜡中，切成 5 微米厚的切片并用苏木精和伊红染色。 供体活检中的脂肪量半定量分级如下 89；无脂肪 = 0 级，1-15% = I 级，16-30% = II 级，31-45% = III 级，> 45% = IV 级。 通过检查每个灌注后活检的 30 个高倍视野 (600x)，对再灌注损伤进行分级（严重程度从 0-10 分）。 计算凋亡细胞，对肝细胞肿胀、3 区出血和坏死进行半定量评分 90。 根据我们之前的工作36，拟议研究中的再灌注评分预计在 0.5 到 5 之间。 病理学家对所有活检的分组分配一无所知。
4. 免疫抑制和急性排斥反应：所有患者都接受他克莫司和类固醇用于免疫抑制。 在肝肾综合征患者中，他克莫司的使用会延迟几天，并且可以比标准剂量低得多的剂量使用。 药理学免疫抑制将通过确定每天类固醇的平均剂量、前五周每周中位他克莫司水平的平均值以及每组中可能接受其他药物（如霉酚酸酯和 IL-2 受体抗体）的接受者比例进行量化. 接受者肝功能衰竭引起的免疫抑制将通过移植时终末期肝病 (MELD) 评分模型进行评估。 移植后肝活检仅在有临床指征时进行。 当存在以下三个标准中的至少两个时，可诊断出急性细胞排斥反应：门静脉单核浸润、胆管炎症/损伤和门静脉和/或终末肝小静脉的内皮下炎症。 拒绝的严重程度根据拒绝活动指数分级如下：0-2 = 无拒绝，3 = 边缘，4-5 = 轻度，6-7 = 中度和 8-9 = 严重 91。 轻度排斥最初通过单独增加 prograf 剂量或与类固醇联合使用来治疗。 类固醇耐药排斥，经活检确认后，用穆罗单抗 (OKT3) 治疗。
5. 血浆 TNF-α、IL-6 和 8 以及可溶性 L-选择素：血浆与全身静脉血分离，再灌注后 3、12、24、48 小时从有和没有 IPC 的肝脏接受者采集，样本储存在 -700C . TNF-α、IL-6 和 IL-8 以及可溶性 L-选择素水平用市售的酶联免疫吸附测定试剂盒（R & D Systems，Minneapolis，MN）一式两份进行定量。 根据制造商的说明进行测定。
6. 嗜中性粒细胞 CD11beta/CD18 和 L-选择素、血小板 P-选择素和血小板-嗜中性粒细胞复合物以及外周血中嗜中性粒细胞的氧化爆发：全身静脉血采集到肝素化 (10 U/ml) 注射器后 3、12、24 和 48 小时有和没有 IPC 的肝脏接受者的再灌注。 将 50 微升血液添加到饱和浓度的荧光素异硫氰酸酯 (FITC) 或藻红蛋白 (PE) 偶联单克隆抗体（Dako Corp, Carpenteria, CA）以 CD 11beta/CD18、CD 62 L（L-选择素）、CD 42 (血小板 von Willebrand 因子受体）和 CD 62P（P-选择素）。 在室温下孵育 10 分钟后，通过添加 200 微升 FACSlyse（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ）裂解红细胞。 孵育 10 分钟后，加入 250 微升含 0.2% 甲醛的 PBS。 在 FasCalibur 流式细胞术（Becton Dickinson，Fair Lakes，NJ）中分析样品。 FITC 的荧光在 515 nm 处测量，PE 在 580 nm 处测量。 嗜中性粒细胞通过其在前向和侧向散点图上易于识别的特征来区分。 至少计算 5000 个中性粒细胞事件。 如 Peters 等人所述，CD 11beta 和 CD 42 染色阳性的事件被认为是 PNC。 为了尽量减少识别个体血小板和中性粒细胞的风险，因为 PNC 流速被调整为 < 4500 事件/秒。 如果荧光强度超过同种型匹配对照抗体的 98%，则结果被视为阳性。 结果表示为中值荧光强度 (MFI)。 如 Vowells 等人所述，通过中性粒细胞产生的活性氧将二氢罗丹明氧化成荧光罗丹明来测量氧化爆发。 简而言之，将 300 微升肝素化全血添加到 4 毫升红细胞裂解缓冲液 (370°C) 中。 孵育五分钟后，将沉淀重悬于含有 5% 胎牛血清的 HBSS 中。 添加 DMSO 中的 1.8 微升 DHR，并在室温下孵育 10 分钟，然后进行流式细胞术分析。 使用 PMA (1microg/ml) 刺激作为阳性对照。
7. 肺水肿：在移植完成后以及术后第 1 天、第 2 天和第 3 天，患者处于半直立位时，在前后投影中进行胸片。肺水肿通过是否存在间质水肿和肺泡来评估符合公认标准的水肿 93。 放射科医师对受试者的分组分配不知情。