Cvičením indukovaná bronchokonstrikce u školních dětí

Metody:

Pacienti a design studie Půjde o dvoustupňovou studii prováděnou mezi školní mládeží. V prvním kroku budou školní děti prověřovány na EIB během hodiny tělesné výchovy (TV). U všech dětí před a po lekce tělesného cvičení (TV) bude provedena spirometrie. Děti se sníženou FEV1 (>=10 % oproti výchozí hodnotě) a/nebo děti s EIB v anamnéze za posledních 12 měsíců (symptomy: dušnost, kašel, sípání, bolest na hrudi během/po cvičení) budou pozvány na kliniku k budoucímu vyhodnocení a budou kvalifikovány k dalšímu kroku studie.

Ve druhém kroku budou na kliniku pozvány děti s podezřením na EIB a jejich rodiče. Naplánovány jsou tři návštěvy. Léčba dlouhodobě působícími beta agonisty bude ukončena 24 hodin před každou návštěvou; léčba antihistaminiky bude ukončena 21 dní před první návštěvou.

První návštěva

U všech dětí bude provedena standardizovaná cvičební výzva spolu s testem reverzibility a kožními prick testy. Na základě těchto výsledků budou děti rozděleny do následujících skupin:

• děti s EIB a astmatem (EIB+A+)
• děti s EIB bez astmatu (EIB+A-)
• děti bez EIB a astmatu (EIB-A+)
• děti bez EIB bez astmatu (EIB-A-) Druhá návštěva Z každé skupiny bude náhodně vybráno dvacet dětí. U všech dětí bude standardizované cvičení trade mil challenge provedeno znovu společně. Vzorek krve bude odebrán před a po stimulaci spolu se vzorkem kondenzátu vydechovaného vzduchu za účelem detekce markerů zánětu. Také před a po zátěžové zátěži bude měřen vydechovaný oxid dusnatý.

Třetí návštěva U každého dítěte bude provedena bronchiální provokační výzva metacholinem.

Metody

• anamnéza a fyzikální vyšetření
• testy plicních funkcí Testy plicních funkcí Testování plicních funkcí bude provedeno pomocí jednotky Master Screen (Erich Jaeger Gmbh-Hochberg, Německo). Předpokládané hodnoty pro všechny proměnné funkce plic jsou založeny na předchozí studii zdravých kontrol poskytnutých výrobcem zařízení pro testování funkce plic. Křivky průtok-objem budou provedeny podle standardů American Thoracic Society. Bude provedeno a analyzováno nejvyšší ze 3 úspěšných měření. Výsledky budou vyjádřeny jako procento předpokládané hodnoty. Všichni účastníci budou schopni provádět spirometrii.
• měření oxidu dusnatého ve vydechovaném vzduchu Měření NO budou prováděna podle doporučení Evropské respirační společnosti/Americké hrudní společnosti (ERS/ATS) s chemiluminiscenčním analyzátorem (model 280i analyzátor oxidu dusnatého; Sievers, Boulder, CO, USA) a vyjádřeno v částech na miliardu . Analyzátor poskytuje on-line kontinuální měření NO v jediném výdechu s detekčním rozsahem 0,1 až 500 ppb. Environmentální NO bude měřeno před a po každém testu a nikdy nepřekročí 5 ppb. Všechny subjekty jsou studovány v sedě, bez nosní svorky. Subjekty vydechují konstantní průtokovou rychlostí (50 ml/s) z celkové kapacity plic do reziduálního objemu bez zadržení dechu. Udržují konstantní tlak v ústech (17 cm H2O) sledováním vizuálního displeje, aby se eliminovala kontaminace z nosního NO. Mrtvý prostor a nosní NO (které jsou reflektovány vrcholem koncentrace NO během výdechu) a NO z dolních dýchacích cest (určeno hodnotou plateau po vrcholu) jsou zaznamenávány automaticky pomocí softwaru výrobce. Budou získána tři měření frakčního vydechovaného oxidu dusnatého (FeNO) fáze plateau s méně než 10% odchylkou. Střední hodnota 3 po sobě jdoucích reprodukovatelných záznamů bude uchována pro statistickou analýzu.
• standardizovaná výzva na cvičení na běžícím pásu Cvičením indukovaná bronchokonstrikce bude testována pomocí motorem poháněného běžeckého pásu (Kettler, Ense-Parsit, Německo) podle pokynů ATS/ERS. Děti dostanou pokyn, aby běžely 8 minut se submaximálním pohybovým zatížením. Zátěžový test se skládá z 2minutového zahřátí a 6 minut ustáleného běhu na běžeckém pásu se sklonem k dosažení srdeční frekvence alespoň 95 % maxima předpokládaného pro věk (vypočteno jako 220 – věk [roky]) . Sklon běžeckého pásu je 5,5 % (3°). V případě potřeby budou provedeny malé úpravy v pracovní zátěži (rychlost běžeckého pásu), aby bylo dosaženo cílových tepových frekvencí. Během testu budou použity nosní klipsy a srdeční frekvence bude nepřetržitě monitorována (elektronický snímač srdeční frekvence; Kettler). Submaximální běh na běžeckém pásu bude prováděn stejnou rychlostí (zátěžová zátěž) při obou testovacích příležitostech (při randomizaci a po 4 týdnech léčby) pro každé dítě. Okolní teplota v klimatizované laboratoři bude udržována stabilní na 22 °C a vlhkost bude stabilní mezi 40 % a 50 % každý den studie. Rozdíly 1 °C v teplotě a 5 mg H2 OxL-1 vlhkosti vzduchu v testovací dny u každého pacienta budou akceptovány. 14 FEV1 bude naměřeno před během, bezprostředně po běhu a 3, 6, 10, 15, 20 a 30 minut po běhu. Maximální procentuální pokles FEV1 po zátěžovém testu bude vypočítán pomocí následujícího vzorce: [(před cvičením FEV1 - nejnižší po cvičení FEV1) /před cvičením FEV1] x 100. Hodnoty FEV1 budou vyneseny proti času pro každé ošetření. Plocha pod křivkou (AUC) pro hodnoty FEV1 ze cvičení po dobu 30 minut bude vypočítána pomocí lichoběžníkového pravidla. EIB bude definována jako ≥ 15% pokles FEV1 od výchozí hodnoty během prvních 5 minut po zátěži.
• kondenzát z vydechovaného dechu Vzorky EBC budou odebírány pomocí zařízení EcoScreen-II (Viasys Healthcare GmbH, Berlín, Německo). Vzorky kondenzátu vydechovaného dechu (EBC) budou odebírány dětem během dechového dýchání s nosní svorkou, jak bylo popsáno dříve [6]. Dvoucestné ventily bez zpětného dýchání a potrubí ke kondenzátoru budou sloužit jako lapač slin. Po odběru (během 10 minut) se EBC rychle zmrazí v malých plastových zkumavkách při -80 °C pomocí suchého ledu a uloží se při -80 °C až do analýzy.

Materiálem bude kondenzát vydechovaného dechu dětí s diagnózou astma. Analýza bude provedena pomocí Quaantibody Human Inflammation Array 3 (RayBiotech, Norcross, GA, USA) podle pokynů výrobce. Tato sada multiplexních ELISA čipů umožňuje kvantitativní měření 40 lidských cytokinů. Každé standardní skleněné sklíčko se skládá ze 16 jamek, z nichž každá má identické pole cytokinových protilátek. Všechny protilátky a pozitivní kontroly budou vytištěny čtyřnásobně v každé jamce.

V prvním kroku se záchytná protilátka naváže na skleněný povrch sklíčka. Dále se do každé jamky přidá 100 ul každého vzorku pacienta a specifické cytokinové standardy známé koncentrace. Po inkubaci po dobu 2 hodin při teplotě místnosti se čip 5krát promyje 150 ul promývacího pufru I a dvakrát 150 ul promývacího pufru II, 5 minut na každé promytí. Poté se čip inkubuje po dobu 2 hodin s 1,4 ml protilátky konjugované s biotinem při teplotě místnosti. Poté se promývací protokol opakuje před přidáním 80 ul Cy3 ekvivalentního streptavidinu konjugovaného s barvivem do každé jamky po dobu 1 hodiny. Po promytí pole je fluorescenční signál detekován a kvantifikován pomocí skeneru Axon GenePix 4000B a softwaru GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices). Výsledky budou analyzovány pomocí Q - Analyzer Software (RayBiotech, Norcross, GA, USA).

• metacholinová bronchiální provokační výzva Metacholinový bronchiální test provokace bude proveden pomocí dozimetrické techniky aerosolový provokační systém (APS) Pro (Erich Jaeger Gmbh-Hochberg, Německo) s řízeným dechovým dýcháním. Po pulverizačním fyziologickém ředidle bude metacholin podáván ve čtyřech kumulativních dávkách: 0,015 mg, 0,045 mg, 0,18 mg, 0,72 mg. Metacholinový provokační test (MBPT) pokračuje s 2minutovými intervaly mezi inhalacemi, dokud nebude dosaženo poklesu usilovného výdechového objemu za 1 s (FEV1) o ≥20 %. Provokativní dávka (PD20) se vypočítá lineární interpolací na křivce log-dávka-odpověď (13).
• ve vzorku krve (5 ml vzorek): hladiny tryptázy, lipoxinu A4 v séru
• také v této studii bude odebrán vzorek krve před a po stimulaci spolu se vzorkem kondenzátu vydechovaného vzduchu za účelem detekce markerů zánětu (jako je interleukin (IL)-1a, IL-2, IL-5, IL-6, IL -8, IL-9, IL-12p70, IL-13, IL-17, IL-22, monocytový chemoatraktant protein jedna (MCP1), Toll-like receptor 2 (TLR2), makrofágový zánětlivý protein jedna alfa (MIP1a), krevní destičky odvozený růstový faktor (PDGFBB), tkáňový inhibitor metaloproteinázy dva (TIMP2), tumor nekrotizující faktor alfa (TNFalfa), C reaktivní protein (CRP), transformující růstový faktor beta jedna (TGF-b1), thymický stromální lymfopoetin (TSLP) - ELISA a cysteinylové leukotrieny, leukotrien B4 (LTB4), prostaglandin E2 - vysokotlaká kapalinová chromatografie ((PGE2-HPLC))/hmotnostní spektrometrie).

Význam:

Praktické hodnocení/Výsledky navrhované studie nám umožní posoudit prevalenci a definovat zánětlivé pozadí námahou indukované bronchokonstrikce (EIB) u školních dětí. Absence ve škole, nemocnost a komorbidita ovlivňující pohybovou aktivitu budou ověřeny a nediagnostikovaní pacienti budou léčeni. Bude ověřena významnost faktorů prostředí (kouření tabáku, druh cvičení, teplota a vlhkost cvičební místnosti) a individuálních (věk, pohlaví, atopie, obezita, recidivující infekce dýchacích cest, přítomnost chronických onemocnění).

Nové poznatky/Hlavní poznatky studie umožní definovat metody primární prevence EIB bez vyhýbání se cvičení a nová doporučení pro léčbu EIB u dětí:

1. EIB screening v reálném živém prostředí (při cvičení ve škole) ověřený standardizovaným zátěžovým testem na klinice
2. Definování individuálních a environmentálních rizikových faktorů EIB u školních dětí
3. Kinetika zánětlivých markerů (v kondenzátu vydechovaného vzduchu a séru) při zátěžovém testu
4. Komplexní hodnocení klinického a zánětlivého profilu pacientů s EIB s/bez astmatu.

Poznatky v terénu/Definovat markery zánětu u EIB a možné rozdíly mezi astmatickými a neastmatickými dětmi s/bez EIB.

Účinky/Cílem projektu je definovat prevalenci a zánětlivé pozadí cvičením indukované bronchokonstrikce (EIB) u školních dětí a určit individuální a environmentální rizikové faktory pro EIB. Získané výsledky poskytnou objektivní měření biologických procesů vedoucích k bronchokonstrikci při zátěži, jak se přirozeně projevuje během školního života. Výsledky by mohly být použity při léčbě pacientů s EIB s astmatem nebo bez něj. Výsledky plánovaného výzkumu budou publikovány v časopisech s národním i mezinárodním dosahem a prezentovány na sympoziích a konferencích.