Skurcz oskrzeli wywołany wysiłkiem fizycznym u dzieci w wieku szkolnym

Metody:

Pacjenci i projekt badania Będzie to dwuetapowe badanie przeprowadzone wśród młodzieży szkolnej. W pierwszym etapie dzieci w wieku szkolnym zostaną przebadane pod kątem EIB podczas lekcji wychowania fizycznego (WF). Wszystkie dzieci przed i po lekcjach ćwiczeń fizycznych (WF) będą miały wykonaną spirometrię. Dzieci z obniżonym FEV1 (>=10% od wartości wyjściowej) i/lub dzieci z EIB w wywiadzie w ciągu ostatnich 12 miesięcy (objawy: duszność, kaszel, sapanie, ból w klatce piersiowej podczas/po ćwiczeniach) zostaną zaproszone do kliniki w celu dalszej oceny i kwalifikacji do kolejnego etapu nauki.

W drugim etapie do poradni zostaną zaproszone dzieci z podejrzeniem EIB oraz ich rodzice. Planowane są trzy wizyty. Leczenie długo działającymi agonistami beta zostanie przerwane 24 godziny przed każdą wizytą; leczenie przeciwhistaminowe zostanie przerwane na 21 dni przed pierwszą wizytą.

Pierwsza wizyta

U wszystkich dzieci wykonane zostaną standaryzowane próby prowokacji wysiłkowej wraz z testem odwracalności i punktowymi testami skórnymi. Na podstawie tych wyników dzieci zostaną podzielone na następujące grupy:

• dzieci z EIB i astmą (EIB+A+)
• dzieci z EIB bez astmy (EIB+A-)
• dzieci bez EIB i astmy (EIB-A+)
• dzieci bez EIB bez astmy (EIB-A-) Druga wizyta Po 20 dzieci zostanie losowo wybranych z każdej grupy. We wszystkich dzieciach powtórzymy wspólne zawody z ćwiczeniami standaryzowanymi. Próbka krwi zostanie pobrana przed i po prowokacji wraz z próbką kondensatu wydychanego powietrza w celu wykrycia markerów stanu zapalnego. Zostanie również zmierzony wydychany tlenek azotu przed i po wysiłku fizycznym.

Wizyta trzecia U każdego dziecka zostanie przeprowadzona prowokacja oskrzelowa metacholiną.

Metody

• historia medyczna i badanie fizykalne
• badania czynności płuc Badania czynności płuc Badania czynności płuc zostaną przeprowadzone za pomocą urządzenia Master Screen (Erich Jaeger Gmbh-Hochberg, Niemcy). Przewidywane wartości dla wszystkich zmiennych czynności płuc są oparte na wcześniejszych badaniach zdrowych osób kontrolnych, dostarczonych przez producenta sprzętu do badania czynności płuc. Krzywe przepływ-objętość zostaną wykonane zgodnie ze standardami American Thoracic Society. Najwyższy z 3 udanych pomiarów zostanie wykonany i przeanalizowany. Wyniki zostaną wyrażone jako procent przewidywanej wartości. Wszyscy badani będą mogli wykonać spirometrię.
• pomiary tlenku azotu w wydychanym powietrzu Pomiary NO będą wykonywane zgodnie z zaleceniami European Respiratory Society/American Thoracic Society (ERS/ATS) za pomocą analizatora chemiluminescencyjnego (analizator tlenku azotu model 280i; Sievers, Boulder, CO, USA) i wyrażone w częściach na miliard . Analizator zapewnia ciągły pomiar on-line NO podczas pojedynczego wydechu z zakresem detekcji od 0,1 do 500 ppb. Środowiskowy NO będzie mierzony przed i po każdym teście i nigdy nie przekroczy 5 ppb. Wszyscy badani są badani w pozycji siedzącej, bez noszenia klipsa na nos. Badani wydychają ze stałą szybkością przepływu (50 ml/s) od całkowitej pojemności płuc do objętości resztkowej bez wstrzymywania oddechu. Utrzymują stałe ciśnienie w jamie ustnej (17 cm H2O) poprzez monitorowanie wyświetlacza wizualnego w celu wyeliminowania zanieczyszczenia przez nosowy NO. Przestrzeń martwa i NO nosowe (które odzwierciedlają szczytowe stężenie NO podczas wydechu) oraz NO z dolnych dróg oddechowych (określone wartością plateau po piku) są rejestrowane automatycznie za pomocą oprogramowania producenta. Otrzymane zostaną trzy pomiary frakcji tlenku azotu w wydychanym powietrzu (FeNO) fazy plateau, z odchyleniami mniejszymi niż 10%. Średnia wartość z 3 kolejnych powtarzalnych zapisów zostanie zachowana do analizy statystycznej.
• standardowe wyzwanie na bieżni wysiłkowej Skurcz oskrzeli wywołany wysiłkiem fizycznym zostanie przetestowany przy użyciu bieżni napędzanej silnikiem (Kettler, Ense-Parsit, Niemcy) zgodnie z wytycznymi ATS/ERS. Dzieci zostaną poinstruowane, aby biegały przez 8 minut z submaksymalnym obciążeniem. Próba wysiłkowa składa się z 2-minutowej rozgrzewki i 6-minutowego biegu w stanie ustalonym na bieżni nachylonej do wytworzenia tętna co najmniej 95% maksymalnego przewidzianego dla wieku (obliczonego jako 220 - wiek [lata]) . Nachylenie bieżni wynosi 5,5% (3°). W razie potrzeby zostaną wprowadzone niewielkie korekty obciążenia pracą (prędkość bieżni), aby osiągnąć docelowe tempo pracy serca. Podczas badania będą używane zaciski do nosa, a tętno będzie stale monitorowane (elektroniczny skaner tętna; Kettler). Submaksymalny bieg na bieżni zostanie przeprowadzony z tą samą prędkością (obciążenie ćwiczenia) w obu przypadkach testowych (w randomizacji i po 4 tygodniach leczenia) dla każdego dziecka. Temperatura otoczenia w klimatyzowanym laboratorium będzie utrzymywana na stabilnym poziomie 22°C, a wilgotność stabilna między 40% a 50% każdego dnia badania. Dopuszczalne będą różnice 1°C temperatury i 5 mg H2OxL-1 wilgotności powietrza w dniach badań u każdego pacjenta. 14 FEV1 zostanie zmierzony przed biegiem, bezpośrednio po nim oraz 3, 6, 10, 15, 20 i 30 minut po biegu. Maksymalny procentowy spadek FEV1 po teście wysiłkowym zostanie obliczony przy użyciu następującego wzoru: [(FEV1 przed wysiłkiem - najniższy FEV1 po wysiłku) /FEV1 przed wysiłkiem] x 100. Wartości FEV1 zostaną wykreślone w funkcji czasu dla każdego zabiegu. Pole pod krzywą (AUC) dla wartości FEV1 z wysiłku w okresie 30 minut zostanie obliczone przy użyciu reguły trapezów. EIB zostanie zdefiniowany jako spadek FEV1 o ≥ 15% w stosunku do wartości wyjściowej w ciągu pierwszych 5 minut po wysiłku.
• próbki EBC kondensatu wydychanego powietrza zostaną pobrane za pomocą urządzenia EcoScreen-II (Viasys Healthcare GmbH, Berlin, Niemcy). Próbki kondensatu wydychanego powietrza (EBC) będą pobierane od dzieci podczas oddychania pływowego z założonym klipsem na nos, jak opisano wcześniej [6]. Dwukierunkowe zawory zapobiegające oddychaniu zwrotnemu i rurki prowadzące do skraplacza będą służyć jako pułapka na ślinę. Po pobraniu (w ciągu 10 minut), EBC zostanie szybko zamrożone w małych plastikowych probówkach w temperaturze -80°C przy użyciu suchego lodu i będzie przechowywane w temperaturze -80°C do czasu analizy.

Materiałem będzie kondensat wydychanego powietrza dzieci z rozpoznaną astmą. Analiza zostanie przeprowadzona przy użyciu Quantibody Human Inflammation Array 3 (RayBiotech, Norcross, GA, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Ten multipleksowy zestaw macierzy ELISA umożliwia ilościowy pomiar 40 ludzkich cytokin. Każde standardowe szkiełko składa się z 16 studzienek, z których każda zawiera identyczny zestaw przeciwciał cytokinowych. Wszystkie przeciwciała i kontrole pozytywne zostaną wydrukowane w czterech powtórzeniach w każdym dołku.

W pierwszym etapie przeciwciało wychwytujące wiąże się ze szklaną powierzchnią szkiełka. Następnie do każdej studzienki dodaje się po 100 µl próbki od każdego pacjenta i specyficzne dla promienia standardy cytokin o znanym stężeniu. Po inkubacji przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, macierz przemywa się 5 razy 150 µl Wash Buffer I i dwukrotnie 150 µl Wash Buffer II, 5 minut na przemycie. Następnie macierz inkubuje się przez 2 godziny z 1,4 ml przeciwciała skoniugowanego z biotyną w temperaturze pokojowej. Następnie powtarza się protokół przemywania przed dodaniem 80 ul równoważnika Cy3 streptawidyny skoniugowanej z barwnikiem do każdej studzienki na 1 godzinę. Po wypłukaniu macierzy sygnał fluorescencji jest wykrywany i oznaczany ilościowo za pomocą skanera Axon GenePix 4000B i oprogramowania GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices). Wyniki zostaną przeanalizowane przy użyciu oprogramowania Q - Analyzer (RayBiotech, Norcross, GA, USA).

• próba prowokacji oskrzelowej z metacholiną Test prowokacji z metacholiną oskrzelową zostanie przeprowadzony przy użyciu techniki dozymetrycznej systemu prowokacji aerozolowej (APS) Pro (Erich Jaeger Gmbh-Hochberg, Niemcy) z kontrolowanym oddechem oddechowym. Po sproszkowaniu rozcieńczalnika fizjologicznego metacholina będzie dostarczana w czterech dawkach kumulacyjnych: 0,015 mg, 0,045 mg, 0,18 mg, 0,72 mg. Test prowokacyjny oparty na metacholinie (MBPT) kontynuuje się z 2-minutowymi przerwami między wdechami, aż do uzyskania spadku natężonej objętości wydechowej w ciągu 1s (FEV1) o ≥20%. Dawkę prowokacyjną (PD20) oblicza się przez interpolację liniową na krzywej log-dawka-odpowiedź (13).
• w próbce krwi (próbka 5 ml): poziomy tryptazy, lipoksyny A4 w surowicy
• również w niniejszym badaniu zostanie pobrana próbka krwi przed i po prowokacji wraz z próbką kondensatu wydychanego powietrza w celu wykrycia markerów stanu zapalnego (takich jak interleukina (IL)-1a, IL-2, IL-5, IL-6, IL -8, IL-9, IL-12p70, IL-13, IL-17, IL-22, białko chemotaktyczne monocytów jeden (MCP1), receptor toll-like 2 (TLR2), makrofagowe białko zapalne jeden alfa (MIP1a), płytki krwi pochodny czynnik wzrostu (PDGFBB), tkankowy inhibitor metaloproteinazy 2 (TIMP2), czynnik martwicy nowotworów alfa (TNFalpha), białko C-reaktywne (CRP), transformujący czynnik wzrostu beta 1 (TGF-b1), limfopoetyna zrębu grasicy (TSLP) - ELISA i leukotrieny cysteinylowe, leukotrien B4 (LTB4), prostaglandyna E2 - wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa ((PGE2-HPLC))/spektrometria mas).

Oznaczający:

Ocena praktyczna/Wyniki proponowanych badań pozwolą ocenić częstość występowania i określić podłoże zapalne skurczu oskrzeli wywołanego wysiłkiem fizycznym (EIB) u dzieci w wieku szkolnym. Nieobecności szkolne, zachorowania i choroby współistniejące wpływające na aktywność fizyczną będą weryfikowane, a niezdiagnozowani pacjenci będą leczeni. Zweryfikowane zostanie znaczenie czynników środowiskowych (palenie tytoniu, rodzaj ćwiczeń, temperatura i wilgotność sali ćwiczeń) oraz indywidualnych (wiek, płeć, atopia, otyłość, nawracające infekcje układu oddechowego, obecność chorób przewlekłych).

Nowe ustalenia/Główne ustalenia badania pozwolą na określenie metod profilaktyki pierwotnej EIB bez unikania wysiłku fizycznego oraz nowe zalecenia dotyczące leczenia EIB u dzieci:

1. Badanie przesiewowe EIB w rzeczywistym środowisku (podczas lekcji ćwiczeń w szkole) zweryfikowane za pomocą standardowego testu wysiłkowego w klinice
2. Określenie indywidualnych i środowiskowych czynników ryzyka EIB u dzieci w wieku szkolnym
3. Kinetyka markerów stanu zapalnego (w kondensacie wydychanego powietrza i surowicy) podczas próby wysiłkowej
4. Kompleksowa ocena profilu klinicznego i zapalnego pacjentów z EIB z/bez astmy.

Wyniki badań terenowych/Określenie markerów stanu zapalnego w EIB i możliwe różnice między dziećmi z astmą i bez astmy z/bez EIB.

Efekty/Celem projektu jest określenie częstości występowania i podłoża zapalnego skurczu oskrzeli wywołanego wysiłkiem fizycznym (EIB) u dzieci w wieku szkolnym oraz określenie indywidualnych i środowiskowych czynników ryzyka wystąpienia EIB. Uzyskane wyniki zapewnią obiektywne pomiary procesów biologicznych prowadzących do skurczu oskrzeli podczas ćwiczeń, co może być naturalnie doświadczane podczas życia szkolnego. Wyniki można zastosować w leczeniu pacjentów z EIB z astmą lub bez astmy. Wyniki planowanych badań zostaną opublikowane w czasopismach o zasięgu krajowym i międzynarodowym oraz zaprezentowane podczas sympozjów i konferencji.