Broncocostrizione indotta dall'esercizio nei bambini in età scolare

Metodi:

Pazienti e disegno dello studio Sarà uno studio in due fasi condotto tra gli adolescenti delle scuole. Nella prima fase i bambini in età scolare saranno selezionati per la BEI durante la lezione di educazione fisica (PE). Inn tutti i bambini prima e dopo la lezione di esercizio fisico (PE) verrà eseguita la spirometria. I bambini con FEV1 ridotto (>=10% rispetto al basale) e/o i bambini con anamnesi di EIB negli ultimi 12 mesi (sintomi: dispnea, tosse, respiro sibilante, dolore toracico durante/dopo gli esercizi) saranno invitati alla clinica per una valutazione futura e qualificati alla fase successiva dello studio.

Nella seconda fase i bambini con sospetta EIB ei loro genitori saranno invitati alla clinica. Sono previste tre visite. Il trattamento con beta agonisti a lunga durata d'azione verrà interrotto 24 ore prima di ogni visita; il trattamento antistaminico verrà interrotto 21 giorni prima della prima visita.

Prima visita

In tutti i bambini verranno eseguiti esercizi standardizzati di commercio mil challenge insieme a test di reversibilità e skin prick test. Sulla base di questi risultati i bambini saranno divisi nei seguenti gruppi:

• bambini con BEI e asma (BEI+A+)
• bambini con EIB senza asma (EIB+A-)
• bambini senza EIB e asma (EIB-A+)
• bambini senza EIB senza asma (EIB-A-) Seconda visita Venti bambini saranno selezionati a caso da ciascun gruppo. In tutti i bambini verranno eseguiti di nuovo insieme esercizi standardizzati di trade mil challenge. Il campione di sangue verrà prelevato prima e dopo il test insieme al campione di condensato del respiro espirato per rilevare i marcatori di infiammazione. Verrà misurata anche la sfida prima e dopo l'esercizio di ossido nitrico esalato.

Terza visita Verrà eseguita in ogni bambino la sfida di provocazione bronchiale con metacolina.

Metodi

• anamnesi ed esame fisico
• test di funzionalità polmonare Test di funzionalità polmonare I test di funzionalità polmonare saranno eseguiti con un'unità Master Screen (Erich Jaeger Gmbh-Hochberg, Germania). I valori previsti per tutte le variabili della funzionalità polmonare si basano su uno studio precedente di controlli sani fornito dal produttore dell'apparecchiatura per il test della funzionalità polmonare. Le curve flusso-volume saranno eseguite secondo gli standard dell'American Thoracic Society. Verrà presa e analizzata la più alta delle 3 misurazioni riuscite. I risultati saranno espressi come percentuale di un valore previsto. Tutti i soggetti saranno in grado di eseguire la spirometria.
• misurazioni dell'ossido nitrico esalato Le misurazioni dell'NO saranno eseguite secondo le raccomandazioni della European Respiratory Society/American Thoracic Society (ERS/ATS) con un analizzatore a chemiluminescenza (analizzatore di ossido nitrico modello 280i; Sievers, Boulder, CO, USA) e decantate in parti per miliardo . L'analizzatore fornisce una misurazione continua in linea di NO in una singola espirazione con un intervallo di rilevamento da 0,1 a 500 ppb. L'NO ambientale verrà misurato prima e dopo ogni test e non supererà mai i 5 ppb. Tutti i soggetti sono studiati in posizione seduta, senza indossare una clip per il naso. I soggetti espirano a un flusso costante (50 ml/s) dalla capacità polmonare totale al volume residuo senza trattenere il respiro. Mantengono una pressione costante della bocca (17 cm H2O) monitorando un display visivo per eliminare la contaminazione da NO nasale. Lo spazio morto e l'NO nasale (che sono riflessi dal picco di concentrazione di NO durante l'espirazione) e l'NO dal tratto respiratorio inferiore (determinato dal valore di plateau dopo il picco) vengono registrati automaticamente utilizzando il software del produttore. Saranno ottenute tre misure frazionali di ossido nitrico esalato (FeNO) della fase di plateau, con una variazione inferiore al 10%. Il valore medio di 3 successive registrazioni riproducibili verrà conservato per l'analisi statistica.
• test standardizzato su tapis roulant La broncocostrizione indotta dall'esercizio sarà testata mediante l'uso di un tapis roulant motorizzato (Kettler, Ense-Parsit, Germania) secondo le linee guida ATS/ERS. Ai bambini verrà chiesto di correre per 8 minuti con un carico di esercizio submassimale. Il test di esercizio consiste in un riscaldamento di 2 minuti e 6 minuti di corsa costante su un tapis roulant inclinato a produrre una frequenza cardiaca di almeno il 95% del massimo previsto per l'età (calcolata come 220 - età [anni]) . La pendenza del tapis roulant è del 5,5% (3°). Se necessario, verranno apportati piccoli aggiustamenti al carico di lavoro (velocità del tapis roulant) per ottenere velocità di rotazione mirate. Durante il test verranno utilizzate clip nasali e la frequenza cardiaca verrà monitorata continuamente (scanner elettronico della frequenza cardiaca; Kettler). La corsa submassimale sul tapis roulant verrà eseguita alla stessa velocità (carico di esercizio) in entrambe le occasioni di test (alla randomizzazione e dopo 4 settimane di trattamento) per ogni bambino. La temperatura ambiente nel laboratorio climatizzato sarà mantenuta stabile a 22°C e l'umidità sarà stabile tra il 40% e il 50% in ogni giorno dello studio. Saranno accettate differenze di 1°C di temperatura e 5 mg H2 OxL-1 di umidità dell'aria nei giorni di test su ciascun paziente. 14 FEV1 sarà misurato prima della corsa, subito dopo e 3, 6, 10, 15, 20 e 30 minuti dopo la corsa. La percentuale massima di riduzione del FEV1 dopo il test da sforzo sarà calcolata utilizzando la seguente formula: [(FEV1 pre-esercizio - FEV1 post-esercizio più basso) /FEV1 pre-esercizio] x 100. I valori FEV1 saranno tracciati rispetto al tempo per ciascun trattamento. L'area sotto la curva (AUC) per i valori FEV1 dall'esercizio nel periodo di 30 minuti verrà calcolata utilizzando una regola trapezoidale. L'EIB sarà definito come una diminuzione ≥ 15% del FEV1 rispetto al basale entro i primi 5 minuti dopo l'esercizio.
• I campioni di EBC del condensato del respiro espirato saranno raccolti attraverso il dispositivo EcoScreen-II (Viasys Healthcare GmbH, Berlino, Germania). Campioni di condensato del respiro esalato (EBC) saranno ottenuti da bambini durante la respirazione di marea mentre indossano una clip per il naso, come descritto in precedenza [6]. Le valvole a due vie non rebreathing e i tubi al condensatore fungeranno da trappola per la saliva. Dopo la raccolta (per 10 minuti), l'EBC sarà rapidamente congelato in piccoli tubi di plastica a -80°C utilizzando ghiaccio secco e conservato a -80°C fino all'analisi.

Il materiale sarà il condensato del respiro esalato di bambini con diagnosi di asma. L'analisi verrà eseguita utilizzando Quantibody Human Inflammation Array 3 (RayBiotech, Norcross, GA, USA) secondo le istruzioni del produttore. Questo kit di array ELISA multiplex consente la misurazione quantitativa di 40 citochine umane. Ogni vetrino standard è costituito da 16 pozzetti, ciascuno con un identico array di anticorpi contro le citochine. Tutti gli anticorpi ei controlli positivi saranno stampati in quadruplicato in ogni pozzetto.

Nella prima fase, l'anticorpo di cattura viene legato alla superficie di vetro del vetrino. Successivamente, vengono aggiunti a ciascun pozzetto 100 µl di ciascun campione del paziente e gli standard di citochine specifici per aray di concentrazione nota. Dopo incubazione per 2 ore a temperatura ambiente, l'array viene lavato 5 volte con 150 µl di Wash Buffer I e due volte con 150 µl di Wash Buffer II, 5 minuti per lavaggio. Successivamente, l'array viene incubato per 2 ore con 1,4 ml dell'anticorpo coniugato con biotina a temperatura ambiente. Quindi il protocollo di lavaggio viene ripetuto prima dell'aggiunta di 80 µl di streptavidina coniugata con colorante equivalente Cy3 a ciascun pozzetto per 1 ora. Dopo aver lavato l'array, il segnale di fluorescenza viene rilevato e quantificato con lo scanner Axon GenePix 4000B e il software GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices). I risultati saranno analizzati utilizzando Q - Analyzer Software (RayBiotech, Norcross, GA, USA).

• test di provocazione bronchiale con metacolina Il test di provocazione bronchiale con metacolina sarà eseguito utilizzando la tecnica dosimetrica del sistema di provocazione aerosol (APS) Pro (Erich Jaeger Gmbh-Hochberg, Germania) con respirazione controllata. Dopo la polverizzazione del diluente fisiologico, la metacolina verrà erogata in quattro dosi cumulative: 0,015 mg, 0,045 mg, 0,18 mg, 0,72 mg. Il test di provocazione basato sulla metacolina (MBPT) viene continuato con intervalli di 2 minuti tra le inalazioni fino a quando non si otterrà una caduta del volume espiratorio forzato in 1s (FEV1) di ≥20%. La dose provocatoria (PD20) è calcolata mediante interpolazione lineare su una curva log-dose-risposta (13).
• nel campione di sangue (campione da 5 ml): triptasi, livelli sierici di lipossina A4
• anche nel presente studio verrà prelevato un campione di sangue prima e dopo il test insieme a un campione di condensato del respiro espirato per rilevare marcatori di infiammazione (come interleuchina (IL)-1a, IL-2, IL-5, IL-6, IL -8, IL-9, IL-12p70, IL-13, IL-17, IL-22, proteina chemoattrattante monocitica uno (MCP1), recettore toll-like 2 (TLR2), proteina infiammatoria macrofagica uno alfa (MIP1a), piastrina fattore di crescita derivato (PDGFBB), inibitore tissutale della metalloproteinasi due (TIMP2), fattore di necrosi tumorale alfa (TNFalfa), proteina C reattiva (CRP), fattore di crescita trasformante beta uno (TGF-b1), linfopoietina stromale timica (TSLP) - ELISA e cisteinil leucotrieni, leucotriene B4 (LTB4), prostaglandina E2 - cromatografia liquida ad alta pressione ((PGE2-HPLC))/spettrometria di massa).

Senso:

Valutazione pratica/I risultati dello studio proposto ci permetteranno di valutare la prevalenza e definire lo sfondo infiammatorio della broncocostrizione indotta dall'esercizio (BEI) nei bambini in età scolare. Saranno verificate le assenze scolastiche, la morbilità e le comorbilità che influenzano l'attività fisica e verranno trattati i pazienti non diagnosticati. Verrà verificata la significatività dei fattori ambientali (fumo di tabacco, tipo di esercizio, temperatura e umidità della palestra) e individuali (età, sesso, atopia, obesità, infezioni ricorrenti del camion respiratorio, presenza di malattie croniche).

Nuovi risultati/principali risultati dello studio consentiranno di definire metodi di prevenzione primaria della BEI senza evitare l'esercizio e nuove raccomandazioni per il trattamento della BEI nei bambini:

1. Screening EIB in un ambiente reale dal vivo (durante la lezione di ginnastica a scuola) verificato mediante test da sforzo standardizzato in clinica
2. Definire i fattori di rischio individuali e ambientali della BEI nei bambini in età scolare
3. Cinetica dei marcatori infiammatori (nel condensato del respiro esalato e nel siero) durante il test da sforzo
4. Valutazione complessa del profilo clinico e infiammatorio dei pazienti con EIB con/senza asma.

Risultati sul campo/Definizione dei marcatori di infiammazione nella BEI e possibili differenze tra bambini asmatici e non asmatici con/senza BEI.

Effetti/L'obiettivo del progetto è definire la prevalenza e lo sfondo infiammatorio della broncocostrizione indotta dall'esercizio (BEI) nei bambini in età scolare e determinare i fattori di rischio individuali e ambientali per la BEI. I risultati ottenuti forniranno misure oggettive sui processi biologici che portano alla broncocostrizione durante l'esercizio, come si potrebbe sperimentare naturalmente durante la vita scolastica. I risultati potrebbero essere applicati nella gestione dei pazienti EIB con o senza asma. I risultati delle ricerche programmate saranno pubblicati su riviste di rilevanza nazionale e internazionale e presentati in occasione di simposi e convegni.