Door inspanning geïnduceerde bronchoconstrictie bij schoolkinderen

methoden:

Patiënten en onderzoeksopzet Het zal een studie in twee stappen zijn, uitgevoerd onder schooltieners. In de eerste stap worden de schoolkinderen gescreend op EIB tijdens de les lichamelijke opvoeding (LO). Inn alle kinderen wordt voor en na de les lichamelijke inspanning (PE) spirometrie uitgevoerd. Kinderen met een verlaagd FEV1 (>=10% ten opzichte van de uitgangswaarde) en/of kinderen met een EIB-geschiedenis in de afgelopen 12 maanden (symptomen: kortademigheid, hoesten, piepende ademhaling, pijn op de borst tijdens/na oefeningen) worden uitgenodigd voor toekomstige evaluatie en gekwalificeerde naar de volgende stap van de studie.

In de tweede stap worden kinderen met vermoedelijke EIB en hun ouders uitgenodigd voor de kliniek. Er zijn drie bezoeken gepland. De behandeling met langwerkende bèta-agonisten wordt 24 uur voor elk bezoek stopgezet; behandeling met antihistaminica wordt 21 dagen voor het eerste bezoek stopgezet.

Eerste bezoek

Bij alle kinderen zullen gestandaardiseerde inspanningstests, mil-uitdagingen, reversibiliteitstests en huidpriktests worden uitgevoerd. Op basis van deze resultaten worden de kinderen ingedeeld in de volgende groepen:

• kinderen met EIB en astma (EIB+A+)
• kinderen met EIB zonder astma (EIB+A-)
• kinderen zonder EIB en astma (EIB-A+)
• kinderen zonder EIB zonder astma (EIB-A-) Tweede bezoek Uit elke groep worden twintig kinderen willekeurig gekozen. Bij alle kinderen wordt de gestandaardiseerde oefening trade mil challenge weer samen uitgevoerd. Voor en na de provocatie zal bloed worden afgenomen samen met een condensaatmonster uit de uitgeademde adem om markers van ontsteking te detecteren. Ook voor en na inspanning wordt de uitgeademde stikstofmonoxide gemeten.

Derde bezoek Bronchiale provocatie met metacholine zal bij elk kind worden uitgevoerd.

methoden

• anamnese en lichamelijk onderzoek
• longfunctietesten Longfunctietesten Longfunctietesten zullen worden uitgevoerd met een Master Screen-eenheid (Erich Jaeger Gmbh-Hochberg, Duitsland). Voorspelde waarden voor alle longfunctievariabelen zijn gebaseerd op een eerdere studie van gezonde controles geleverd door de fabrikant van de longfunctietestapparatuur. Flow-volume curves zullen worden uitgevoerd volgens de normen van de American Thoracic Society. De hoogste van 3 geslaagde metingen wordt genomen en geanalyseerd. De resultaten worden uitgedrukt als het percentage van een voorspelde waarde. Alle proefpersonen kunnen spirometrie uitvoeren.
• metingen van uitgeademd stikstofmonoxide De NO2-metingen worden uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de European Respiratory Society/American Thoracic Society (ERS/ATS) met een chemiluminescentieanalysator (model 280i stikstofmonoxideanalysator; Sievers, Boulder, CO, VS) en uitgedrukt in delen per miljard . De analysator biedt een on-line continue meting van NO in een enkele uitademing met een detectiebereik van 0,1 tot 500 ppb. Omgevings-NO wordt voor en na elke test gemeten en zal nooit hoger zijn dan 5 ppb. Alle proefpersonen worden zittend bestudeerd, zonder een neusklem te dragen. De proefpersonen ademen uit met een constante stroomsnelheid (50 ml/s) van de totale longcapaciteit naar het restvolume zonder adem in te houden. Ze handhaven een constante monddruk (17 cm H2O) door een visuele weergave te bewaken om verontreiniging door neus-NO te elimineren. Dode ruimte en nasale NO (die worden weerspiegeld door de NO-concentratiepiek tijdens uitademing) en NO van de onderste luchtwegen (bepaald door de plateauwaarde na de piek) worden automatisch geregistreerd met behulp van de software van de fabrikant. Er zullen drie fractionele uitgeademde stikstofmonoxide (FeNO) metingen van de plateaufase worden verkregen, met minder dan 10% variatie. De gemiddelde waarde van 3 opeenvolgende, reproduceerbare opnames wordt bewaard voor statistische analyse.
• gestandaardiseerde training op de loopband Oefening-geïnduceerde bronchoconstrictie zal worden getest door het gebruik van een motoraangedreven loopband (Kettler, Ense-Parsit, Duitsland) volgens de ATS/ERS-richtlijnen. De kinderen krijgen de instructie om 8 minuten te rennen met een submaximale inspanningsbelasting. De inspanningstest bestaat uit een warming-up van 2 minuten en 6 minuten stationair draaien op een loopband die geneigd is om een ​​hartslag te produceren van ten minste 95% van het maximaal voorspelde voor leeftijd (berekend als 220 - leeftijd [jaren]) . De helling van de loopband is 5,5% (3°). Kleine aanpassingen in werklast (loopbandsnelheid) zullen, indien nodig, worden gemaakt om de beoogde hartfrequenties te bereiken. Tijdens de test worden neusclips gebruikt en wordt de hartslag continu gecontroleerd (elektronische hartslagscanner; Kettler). Het submaximaal hardlopen op de loopband zal bij beide testmomenten (bij randomisatie en na 4 weken behandeling) voor elk kind met dezelfde snelheid (inspanningsbelasting) worden uitgevoerd. De omgevingstemperatuur in het geklimatiseerde laboratorium zal stabiel worden gehouden op 22°C en de luchtvochtigheid zal stabiel zijn tussen 40% en 50% op elke dag van het onderzoek. Verschillen van 1°C in temperatuur en 5 mg H2OxL-1 luchtvochtigheid op de testdagen per patiënt worden geaccepteerd. 14 FEV1 wordt gemeten vóór het hardlopen, direct erna en 3, 6, 10, 15, 20 en 30 minuten na het hardlopen. De maximale procentuele daling van FEV1 na inspanningstest wordt berekend met de volgende formule: [(FEV1 vóór inspanning - laagste FEV1 na inspanning) /FEV1 vóór inspanning] x 100. De FEV1-waarden worden voor elke behandeling uitgezet tegen de tijd. Het gebied onder de curve (AUC) voor de FEV1-waarden van inspanning gedurende de periode van 30 minuten wordt berekend met behulp van een trapeziumregel. EIB wordt gedefinieerd als een afname van ≥ 15% in FEV1 ten opzichte van de uitgangswaarde binnen de eerste 5 minuten na inspanning.
• uitgeademde adem condensaat EBC-monsters zullen worden verzameld via het EcoScreen-II-apparaat (Viasys Healthcare GmbH, Berlijn, Duitsland). Monsters van uitgeademde ademcondensaat (EBC) zullen worden verkregen van kinderen tijdens getijde-ademhaling terwijl ze een neusklem dragen, zoals eerder beschreven [6]. De tweeweg non-rebreathing kleppen en slangen naar de condensor dienen als speekselvanger. Na verzameling (gedurende 10 minuten) wordt EBC snel ingevroren in kleine plastic buisjes bij -80°C met behulp van droogijs en wordt het bewaard bij -80°C tot analyse.

Het materiaal zal het condensaat van de uitgeademde lucht zijn van kinderen met de diagnose astma. De analyse wordt uitgevoerd met behulp van Quantibody Human Inflammation Array 3 (RayBiotech, Norcross, GA, VS) volgens de instructies van de fabrikant. Deze multiplex ELISA-arraykit maakt kwantitatieve meting van 40 menselijke cytokines mogelijk. Elk standaard objectglaasje bestaat uit 16 putjes, elk met een identieke reeks cytokine-antilichamen. Alle antilichamen en positieve controles worden in elk putje in viervoud afgedrukt.

In de eerste stap wordt het capture-antilichaam aan het glasoppervlak van het objectglaasje gebonden. Vervolgens wordt 100 µl van elk patiëntmonster en de aray-specifieke cytokinestandaarden met bekende concentratie aan elk putje toegevoegd. Na incubatie gedurende 2 uur bij kamertemperatuur wordt de reeks 5 keer gewassen met 150 µl wasbuffer I en tweemaal met 150 µl wasbuffer II, 5 minuten per wasbeurt. Vervolgens wordt de array 2 uur geïncubeerd met 1,4 ml van het biotine-geconjugeerde antilichaam bij kamertemperatuur. Vervolgens wordt het wasprotocol herhaald voordat gedurende 1 uur 80 µl Cy3-equivalent kleurstof-geconjugeerd streptavidine aan elk putje wordt toegevoegd. Na het wassen van de array wordt het fluorescentiesignaal gedetecteerd en gekwantificeerd met de Axon GenePix 4000B-scanner en GenePix Pro 6.0-software (Molecular Devices). De resultaten zullen worden geanalyseerd met behulp van Q-Analyzer Software (RayBiotech, Norcross, GA, VS).

• metacholine bronchiale provocatie-uitdaging Metacholine bronchiale test van de provocatie zal worden uitgevoerd met behulp van de dosimetertechniek aerosol provocatiesysteem (APS) Pro (Erich Jaeger Gmbh-Hochberg, Duitsland) met gecontroleerde getijdenademhaling. Na het verpulverende fysiologische verdunningsmiddel wordt methacholine in vier cumulatieve doses toegediend: 0,015 mg, 0,045 mg, 0,18 mg, 0,72 mg. Op metacholine gebaseerde provocatietest (MBPT) wordt voortgezet met intervallen van 2 minuten tussen de inhalaties totdat een daling van het geforceerde expiratoire volume in 1 s (FEV1) van ≥20% wordt verkregen. Provocerende dosis (PD20) wordt berekend door lineaire interpolatie op een log-dosis-responscurve (13).
• in bloedmonster (5 ml monster): tryptase, lipoxine A4 serumspiegels
• ook in de huidige studie zal bloedmonster worden genomen voor en na provocatie samen met uitgeademde adem condensaatmonster om markers van ontsteking te detecteren (zoals interleukine (IL)-1a, IL-2, IL-5, IL-6, IL -8, IL-9, IL-12p70, IL-13, IL-17, IL-22, monocyt chemoattractant eiwit één (MCP1), toll-like receptor 2 (TLR2), macrofaag inflammatoir eiwit één alfa (MIP1a), bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGFBB), weefselremmer van metalloproteïnase twee (TIMP2), tumornecrosefactor-alfa (TNFalfa), C-reactief proteïne (CRP), transformerende groeifactor bèta-één (TGF-b1), thymus stromale lymfopoëtine (TSLP) - ELISA en cysteïnylleukotriënen, leukotrieen B4 (LTB4), prostaglandine E2 - hogedrukvloeistofchromatografie ((PGE2-HPLC))/massaspectrometrie).

Betekenis:

Praktische beoordeling/De resultaten van de voorgestelde studie zullen ons in staat stellen de prevalentie te beoordelen en de inflammatoire achtergrond van inspanningsgeïnduceerde bronchoconstrictie (EIB) bij schoolkinderen te definiëren. Schoolverzuim, morbiditeit en comorbiditeit die van invloed zijn op fysieke activiteit zullen worden geverifieerd en niet-gediagnosticeerde patiënten zullen worden behandeld. De significantie van omgevingsfactoren (roken van tabak, type training, temperatuur en vochtigheid van de fitnessruimte) en individuele factoren (leeftijd, geslacht, atopie, obesitas, terugkerende luchtweginfecties, aanwezigheid van chronische ziekten) zal worden geverifieerd.

Nieuwe bevindingen/hoofdbevindingen van het onderzoek zullen het mogelijk maken primaire preventiemethoden van EIB te definiëren zonder inspanningsvermijding, en nieuwe aanbevelingen voor EIB-behandeling bij kinderen:

1. EIB-screening in de praktijk (tijdens bewegingsles op school), geverifieerd door gestandaardiseerde inspanningstest in de kliniek
2. Definitie van de individuele en omgevingsrisicofactoren van EIB bij schoolkinderen
3. Kinetiek van ontstekingsmarkers (in uitgeademd ademcondensaat en serum) tijdens inspanningstest
4. Complexe evaluatie van klinisch en inflammatoir profiel van patiënten met EIB met/zonder astma.

Bevindingen in het veld/Het definiëren van ontstekingsmarkers bij EIB en mogelijke verschillen tussen astmatische en niet-astmatische kinderen met/zonder EIB.

Effecten/Het doel van het project is om de prevalentie en inflammatoire achtergrond van inspanningsgeïnduceerde bronchoconstrictie (EIB) bij schoolkinderen te bepalen en individuele en omgevingsrisicofactoren voor EIB te bepalen. De verkregen resultaten zullen objectieve maatstaven opleveren voor biologische processen die leiden tot bronchoconstrictie tijdens inspanning, zoals die van nature kan optreden tijdens het schoolleven. De resultaten zouden kunnen worden toegepast bij de behandeling van EIB-patiënten met of zonder astma. De resultaten van gepland onderzoek worden gepubliceerd in tijdschriften met nationale en internationale impact en gepresenteerd tijdens symposia en conferenties.