Mikrovaskulární dysfunkce u obezity

25 sedavých obézních třídy 2 a výše [index tělesné hmotnosti (BMI) >35 kg/m2, obvod pasu >40 palců (muži) nebo >35 palců (ženy)] muži a ženy (18–45 let) se zúčastní tyto experimenty. Jedinci mladší 18 let nebudou vyšetřováni kvůli invazivní povaze protokolu. Jedinci starší 45 let nebudou vyšetřováni kvůli poklesu endoteliální funkce souvisejícímu s věkem. Nebudou existovat žádná omezení s ohledem na rasu, pohlaví nebo socioekonomický status. Ženy budou premenopauzální, budou na kombinované hormonální antikoncepční léčbě estrogen/progestin (perorální pilulka, transdermální náplast nebo vaginální kroužek) a budou studovány v rámci sedmidenní inaktivní (placebo) fáze hormonální antikoncepční terapie (srovnatelné s časnou folikulární fází u normální menstruační cyklus ověřený analýzou estradiolu v krvi). Zajištění důslednosti ve studiu žen během fáze hormonální antikoncepční terapie s nejnižšími plazmatickými koncentracemi estradiolu je důležité vzhledem ke známým pozitivním účinkům estradiolu na endoteliální funkci. Sedaví obézní jedinci budou mít stabilní hmotnost po dobu předchozích 6 měsíců a budou mít metabolický syndrom. Metabolický syndrom bude definován podle nejpoužívanějších kritérií pro metabolický syndrom z 3. zprávy expertního panelu Národního vzdělávacího programu o cholesterolu pro detekci, hodnocení a léčbu vysoké hladiny cholesterolu v krvi u dospělých (Panel léčby dospělých III). Jedinci s metabolickým syndromem mají alespoň tři z následujících příznaků: 1) Centrální obezita měřená obvodem pasu (muži > 40 palců; ženy > 35 palců); 2) Triglyceridy v krvi nalačno > 150 mg/dl; 3) HDL cholesterol v krvi u mužů <40 mg/dl a žen <50 mg/dl; 4) Krevní tlak > 130/85 mmHg; 5) Glukóza v krvi nalačno > 110 mg/dl a (ne na ATP III) 2-hodinová GTT glukóza 140-200 mg/dl.

Před účastí v této studii podstoupí subjekty anamnézu, fyzikální vyšetření a screening na kardiovaskulární onemocnění a diabetes 2. typu. Hodnocení se skládají z odstupňovaného zátěžového testu na běžeckém pásu, krevní chemie, analýzy tělesného složení pomocí duální rentgenové absorptiometrie (DXA) a měření minimálního obvodu pasu (mezi xiphoidním výběžkem a pupkem).

Vyloučení Subjekty účastnící se cíleného tréninku vytrvalostního cvičení (>20 min/den, >1 den/týden) budou vyloučeny. Ženy před menopauzou nesmějí být těhotné ani kojící a musí mít v posledním roce pravidelné menstruační cykly. U všech subjektů bude proveden screening na kardiovaskulární a periferní vaskulární onemocnění. Jedinci užívající léky, které mohou ovlivnit centrální nebo periferní oběh, užívají nesteroidní protizánětlivé látky nebo inhibitory zpětného vychytávání serotoninu, kouří nebo žvýkají tabák, mají cukrovku (glykémie nalačno >125 mg/dl), hypertenzi >160/95 mmHg (jednotlivci s diabetem a vysokým stupněm hypertenze budou vyloučeni, aby byla zachována jednotnější skupina jedinců s metabolickým syndromem), městnavým srdečním selháním, anginou pectoris nebo onemocněním periferních cév. Jedinci se známkami závažných arytmií a/nebo akutní ischemie myokardu odrážející se v depresi ST segmentu o 1 mm nebo větší v klidu nebo během zátěže budou vyloučeni. Vyloučeni budou jedinci s chronickými infekcemi, paralýzou v důsledku cévní mozkové příhody, pokročilou Parkinsonovou chorobou, těžkou revmatoidní artritidou nebo jinými závažnými ortopedickými problémy, které by bránily plnění úkolů cvičebního tréninku. Subjektům nebude povoleno užívat antioxidační, bylinné nebo vitamínové doplňky alespoň 2 týdny před vyšetřením, protože se ukázalo, že některé z těchto činidel zlepšují vazodilataci závislou na endotelu. Subjektům nebude v den experimentu povoleno požít kofein. Subjekty budou vyloučeny, pokud se váha změní o více než 5 % během tréninkového programu nebo pokud jejich dodržování cvičení je pod 90 % cvičení nebo celkové doby cvičení.

Časový rámec: Subjekty budou přijímány, prověřovány, zařazovány a testovány během měsíců 3-28 tohoto grantu. Během prvních 2 měsíců projektu proběhnou náborové procedury a obstarání potřebných dodávek. Další nábor, stejně jako screening a testování subjektů budou probíhat v 1měsíčních cyklech během následujících 25 měsíců rychlostí přibližně 1 na cyklus. Před i po 8 týdnech cvičení bude tedy na účastnících provedeno 25 mikrodialyzačních experimentů, celkem tedy 50 mikrodialyzačních experimentů. Tento plán bude tedy během testovacích měsíců vyžadovat v průměru 2 mikrodialyzační testy za měsíc. Testování těchto subjektů zahrnuje šest hodin pro postup mikrodialýzy. Biochemická analýza vzorků vyžaduje přibližně šest hodin na experiment a redukce dat dalších pět hodin na experiment. Další čas (pět hodin týdně) je vyžadován pro nábor předmětu, předběžné testování a následnou kontrolu. Cíle náboru a testování jsou proto realistické ve světle přiděleného personálu a procentuálního úsilí ve spojení s personálem a zdroji, které nejsou účtovány z grantu.

Mikrodialýza (před a po tréninku):

Subjekty se po celonočním půstu hlásí do Hicknerovy laboratoře. Zatímco subjekty tiše odpočívají, odebere se přes noc odběr krve na lačno z antekubitální žíly, která má být analyzována na tradiční (inzulín, glukóza, lipidy, c-reaktivní protein) a netradiční [(cytokiny TNF-alfa, IL-6, IL-13, intercelulární adhezní molekula-1 (ICAM-1), vaskulární adhezní molekula-1 (VCAM-1) a P-selektin] rizikové/zánětlivé markery kardiometabolického onemocnění v krvi pomocí ELISA od společnosti EMD Millipore nebo našeho klinického analyzátoru (Přístupové systémy Beckman). Kromě toho bude plazmatický glutathion (GSH/GSSG) analyzován jako marker systémového oxidačního stresu pomocí soupravy od Percipio Biosciences (Bioxytech GSH/GSSG).

Postup mikrodialýzy Sedm mikrodialyzačních sond (CMA 20: 10 mm * 0,5 mm 20 kilodaltonová cutoff membrána, délka dříku sondy 5 cm, vstupní hadička a výstupní hadička 20 cm; CMA/Mikrodialýza, Stockholm, Švédsko) bude perkutánně zavedeno, 3 cm od sebe, do vastu lateralis m. quadriceps femoris (3-4 sondy na nohu) za použití sterilní techniky v lokální anestezii (1% lidokain). Sondy budou perfundovány vhodným roztokem rychlostí 2,0 ul/min pomocí mikroinfuzních pump CMA/102 (CMA/Microdialyza, Stockholm, Švédsko) podle plánu v tabulce 2.

Kontrolní perfuzní roztok se bude skládat ze sterilního fyziologického roztoku obsahujícího 5 mM ethanolu (pro měření průtoku krve/mikrovaskulární výměny). Dvě ze sond budou zpočátku perfundovány tímto kontrolním roztokem, zatímco ostatní sondy budou perfundovány inhibitory NADPH oxidázy. Subjekty budou v sedě odpočívat po dobu 60 minut, aby se umožnilo zotavení ze zavedení sondy a ekvilibrace perfuzátu s místním prostředím. Fáze 1: Během následujících 30 minut budou odebrány tři 10minutové vzorky dialyzátu do uzavřených 150 µl polyethylenových odběrových lahviček, aby se stanovil bazální nutriční tok v nepřítomnosti (sonda 1) a přítomnosti (sondy 3-7) inhibitorů NADPH oxidázy, a sloužit jako kontrolní období uvnitř sondy před perfuzí SNP (sonda 2). Fáze 2: Roztoky perfuzátu ve druhé sondě budou poté vyměněny tak, aby obsahovaly kontrolní roztok plus 50 mM nitroprusid sodný (SNP: pro kontrolu změn nezávislých na endotelu). 100 µM Amplex UltraRed a 1 U/ml křenové peroxidázy (HRP) bude přidáno do perfuzátu v ostatních sondách pro měření in vivo produkce H2O2. Během následujících 60 minut se pak odeberou tři dvacetiminutové vzorky dialyzátu, aby se tato měření zajistila v nepřítomnosti superoxiddismutázy. Fáze 3: 10 U/ml superoxiddismutázy (SOD) bude poté přidáno k perfuzátům obsahujícím Amplex UltraRed/HRP. Tři dvacetiminutové vzorky dialyzátu budou poté shromážděny během následujících 60 minut, aby bylo možné měřit účinky SNP, 1 mM apocyninu, 100 nM MitoTempo, 100 uM MitoTempo+Apocynin, 100 nM GKT 137831 nebo 100 nM GKT31+13cy v nepřítomnosti 137. DRN. Fáze 4: Roztoky perfuzátu v sondách 2 až 7 budou poté změněny tak, aby obsahovaly kontrolní roztok plus buď 50 mM Ach (pro stanovení změn závislých na endotelu), nebo 50 mM ACh + buď 1 mM apocynin, 100 nM MitoTempo, 100 uM MitoTempo+ Apocynin, 100 nM GKT 137831 nebo 100 nM GKT 137831+Apocynin (k určení, zda inhibice NADPH oxidázy nebo mitochondriální produkce ROS zlepšuje odpověď závislou na endotelu). Sondy budou poté perfundovány po dobu 60 minut, aby se umožnila rovnováha s místním prostředím. Během následujících 30 minut se pak odeberou tři desetiminutové vzorky, aby se určily účinky ACH na tok živin v přítomnosti a nepřítomnosti NADPH oxidázy nebo inhibice mitochondriálního ROS. U každého vzorku, kde jsou Amplex UltraRed a HRP přidány do perfuzního média, bude okamžitě změřeno 30 µl dialyzátu na H2O2 v laboratorním fluorometru. U každého vzorku, kde se měří průtok krve, bude dialyzát uchováván při 4 °C a analyzován na etanol (pro průtok krve/mikrovaskulární výměnu) do 24 hodin. Všechny perfuzáty a dialyzáty budou chráněny před vystavením světlu.

Poměr odtok/přítok ethanolu z mikrodialýzy Etanol (5 mM) bude zahrnut do perfuzního média pro monitorování nutričního průtoku krve/mikrovaskulární výměny v oblasti mikrodialyzační sondy, jak je popsáno v našich předchozích publikacích 30-32.

Stanovení maximální aerobní kapacity (před a po zátěžovém tréninku):

Všechny subjekty provedou standardizovaný test maximální zátěže na běžeckém pásu při zápisu do studia a znovu po ukončení tréninkového programu. Subjekty si individuálně upraví rychlost a sklon (3-6 km·h-1, 0-5 %) po dobu 5 minut zahřívání. Po zahřívací periodě bude vydechovaný O2 a CO2 subjektu nepřetržitě monitorován pomocí spirometrie s otevřeným okruhem (TrueOne 2400; Parvomedics; Salt Lake City, UT). Test VO2peak bude proveden pomocí protokolu ramp, kde bude rychlost konstantní a sklon se bude každé dvě minuty zvyšovat o 2 %, dokud nebude dosaženo VO2peak. Počáteční rychlost bude individuálně upravena na základě rychlosti zahřívání a srdeční frekvence s cílem dosáhnout VO2peak během 8-12 minut.

Tréninkový protokol Všichni účastníci budou provádět aerobní intervalový trénink třikrát týdně ve dnech, které nejdou po sobě, po dobu osmi týdnů. Cvičení se bude skládat z chůze/běhání po svahu na běžeckém pásu. Subjekty se zahřejí po dobu 10 minut při 70 % maximální srdeční frekvence (HRmax, jak bylo stanoveno během testu VO2peak), než provedou čtyři 4minutové intervaly při 90 % HRmax s 3minutovou aktivní regenerací při 70 % HRmax mezi intervaly a 5minutové období ochlazování, což dává celkovou dobu cvičení 40 minut.

Stanovení tělesného složení Beztuková hmota, tuková hmota a procento tělesného tuku budou stanoveny pomocí rentgenové absorptiometrie s duální energií (DXA; GE Lunar Prodigy Advance, Madison WI). Tělesná hmotnost a výška budou měřeny pro výpočet indexu tělesné hmotnosti (BMI: kg/m2). Budou také měřeny minimální obvody pasu a maximální obvody boků, aby mohly být potenciálně použity jako kovariát ve statistických analýzách kvůli vztahu poměru w/h a obvodu pasu s rizikem kardio-metabolického onemocnění.

Svalové markery oxidačního stresu:

Biopsie budou proto odebrány v klidovém stavu před a po školení u těch účastníků, kteří souhlasí s postupem biopsie. Perkutánní svalové biopsie budou získány z vastus lateralis m. quadriceps femoris (prochází adaptací na navrhovaný zátěžový trénink) sterilními postupy a po podání lokální anestezie (1% lidokain).