Disfunção Microvascular na Obesidade

Vinte e cinco sedentários classe 2 e acima de obesos [índice de massa corporal (IMC) >35 kg/m2, circunferência da cintura >40 polegadas (homens) ou >35 polegadas (mulheres)] homens e mulheres (18-45 anos) participarão esses experimentos. Indivíduos menores de 18 anos não serão investigados devido à natureza invasiva do protocolo. Indivíduos com mais de 45 anos de idade não serão investigados devido ao declínio relacionado à idade na função endotelial. Não haverá restrições quanto a raça, sexo ou condição socioeconômica. As mulheres estarão na pré-menopausa, farão terapia contraceptiva hormonal combinada de estrogênio/progestina (pílula oral, adesivo transdérmico ou anel vaginal) e serão estudadas durante a fase inativa (placebo) de sete dias da terapia contraceptiva hormonal (comparável à fase folicular inicial em o ciclo menstrual normal; verificado por análises de estradiol no sangue). Garantir a consistência no estudo das mulheres durante a fase da terapia anticoncepcional hormonal com as menores concentrações plasmáticas de estradiol é importante devido aos conhecidos efeitos positivos do estradiol na função endotelial. Indivíduos obesos sedentários terão o peso estável nos últimos 6 meses e terão a Síndrome Metabólica. A Síndrome Metabólica será definida de acordo com os critérios mais amplamente utilizados para a Síndrome Metabólica do Terceiro Relatório do Painel de Especialistas do Programa Nacional de Educação sobre Colesterol sobre Detecção, Avaliação e Tratamento do Colesterol Alto em Adultos (Painel de Tratamento para Adultos III). Indivíduos com a Síndrome Metabólica têm pelo menos três dos seguintes: 1) Obesidade central medida pela circunferência da cintura (homens >40 polegadas; mulheres >35 polegadas); 2) Triglicerídeos sanguíneos em jejum > 150 mg/dL; 3) colesterol HDL no sangue em homens <40 mg/dL e mulheres <50 mg/dL; 4) Pressão arterial > 130/85 mmHg; 5) Glicemia em jejum > 110 mg/dL e (não por ATP III) GTT em 2 horas de 140-200 mg/dl.

Antes de participar deste estudo, os indivíduos passarão por um histórico médico, exame físico e triagem para doenças cardiovasculares e diabetes tipo 2. As avaliações consistem em um teste de esforço gradual em esteira, uma química do sangue, análise da composição corporal por Absorciometria de raios X duplos (DXA) e uma medida da circunferência abdominal mínima (entre o processo xifóide e o umbigo).

Exclusões Indivíduos que participam de treinamento de exercício de resistência proposital (>20 min/dia, >1 dia/semana) serão excluídos. Indivíduos do sexo feminino na pré-menopausa não devem estar grávidas ou amamentando e devem ter tido ciclos menstruais regulares no último ano. Todos os indivíduos serão rastreados para doenças cardiovasculares e vasculares periféricas. Indivíduos que fazem uso de medicamentos que podem afetar a circulação central ou periférica, fazem uso de anti-inflamatórios não esteróides ou inibidores da recaptação de serotonina, fumam ou mascam tabaco, têm diabetes (glicemia de jejum >125 mg/dL), hipertensão >160/95 mmHg (indivíduos com diabetes e alto grau de hipertensão serão excluídos para manter um grupo mais uniforme de indivíduos com síndrome metabólica), insuficiência cardíaca congestiva, angina ou doença vascular periférica. Serão excluídos indivíduos com evidências de arritmias graves e/ou isquemia miocárdica aguda refletidas em infradesnivelamento do segmento ST maior ou igual a 1 mm em repouso ou durante o exercício. Indivíduos com infecções crônicas, paralisia devido a acidente vascular cerebral, doença de Parkinson avançada, artrite reumatóide grave ou outros problemas ortopédicos graves que impeçam o desempenho das tarefas de treinamento físico serão excluídos. Os indivíduos não poderão tomar suplementos antioxidantes, fitoterápicos ou vitamínicos por pelo menos 2 semanas antes da investigação, uma vez que alguns desses agentes demonstraram melhorar a vasodilatação dependente do endotélio. Os indivíduos não poderão ingerir cafeína no dia do experimento. Os indivíduos serão excluídos se o peso mudar em mais de 5% durante o programa de treinamento ou se a adesão ao exercício for inferior a 90% das sessões de exercício ou tempo total de exercício.

Prazo: Os indivíduos serão recrutados, selecionados, inscritos e testados durante os meses 3-28 desta concessão. Os procedimentos de recrutamento de indivíduos e a aquisição dos suprimentos necessários ocorrerão durante os primeiros 2 meses do projeto. Recrutamento adicional, bem como triagem e teste de indivíduos ocorrerão em ciclos de 1 mês ao longo dos 25 meses seguintes a uma taxa de aproximadamente 1 por ciclo. Vinte e cinco experimentos de microdiálise serão, portanto, realizados em participantes antes e depois de 8 semanas de treinamento físico, para um total de 50 experimentos de microdiálise. Este plano exigirá, portanto, 2 testes de microdiálise por mês, em média, durante os meses de teste. O teste desses indivíduos inclui seis horas para o procedimento de microdiálise. A análise bioquímica das amostras requer aproximadamente seis horas por experimento e a redução de dados outras cinco horas por experimento. Tempo adicional (cinco horas por semana) é necessário para o recrutamento de sujeitos, testes preliminares e acompanhamento. As metas de recrutamento e teste são, portanto, realistas à luz do pessoal e dos esforços percentuais alocados, juntamente com o pessoal e os recursos não cobrados da subvenção.

Microdiálise (antes e depois do treino de exercício):

Os indivíduos se apresentarão no laboratório Hickner após um jejum noturno. Enquanto os indivíduos estão em repouso tranquilo, uma coleta de sangue em jejum noturno será obtida de uma veia antecubital para ser analisada para tradicional (insulina, glicose, lipídios, proteína c-reativa) e não tradicional [(citocinas TNF-alfa, IL-6, IL-13, molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), molécula de adesão vascular-1 (VCAM-1) e P-selectina] marcadores de risco de doença cardiometabólica/inflamatória no sangue usando ELISA da EMD Millipore, ou nosso analisador clínico (sistemas de acesso Beckman). Além disso, a glutationa plasmática (GSH/GSSG) será analisada como um marcador de estresse oxidativo sistêmico usando um kit da Percipio Biosciences (Bioxytech GSH/GSSG).

Procedimento de microdiálise Sete sondas de microdiálise (CMA 20: 10 mm * 0,5 mm, membrana de corte de 20 kilodalton, comprimento do eixo da sonda de 5 cm, tubo de entrada e tubo de saída de 20 cm; CMA/Microdiálise, Estocolmo, Suécia) serão inseridos percutaneamente, com 3 cm de distância, no vasto lateralis do grupo muscular do quadríceps femoral (3-4 sondas por perna) usando técnica estéril sob anestesia local (lidocaína a 1%). As sondas serão perfundidas com a solução apropriada a uma taxa de 2,0 µL/min usando bombas de microinfusão CMA/102 (CMA/Microdiálise, Estocolmo, Suécia) de acordo com o cronograma da Tabela 2.

A solução de perfusão de controle consistirá em uma solução salina estéril contendo 5 mM de etanol (para medidas de fluxo sanguíneo/troca microvascular). Duas das sondas serão inicialmente perfundidas com esta solução de controle, enquanto as outras sondas serão perfundidas com inibidores da NADPH oxidase. Os indivíduos descansarão sentados por 60 minutos para permitir a recuperação da inserção da sonda e o equilíbrio do perfusato com o ambiente local. Fase 1: Três amostras de dialisato de 10 minutos serão coletadas nos 30 minutos subsequentes em frascos de coleta de polietileno de 150 µL tampados para determinar o fluxo nutritivo basal na ausência (sonda 1) e presença (sondas 3-7) dos inibidores da NADPH oxidase, e para servir como um período de controle intra-sonda antes da perfusão SNP (Sonda 2). Fase 2: As soluções de perfusato na segunda sonda serão então alteradas para conter a solução de controle mais 50 mM de nitroprussiato de sódio (SNP: para controlar alterações não dependentes do endotélio). 100 µM de Amplex UltraRed e 1 U/mL de peroxidase de rábano (HRP) serão adicionados ao perfusato nas demais sondas para medição da produção in vivo de H2O2. Três amostras de dialisato de vinte minutos serão coletadas nos 60 minutos subsequentes para fornecer essas medidas na ausência de superóxido dismutase. Fase 3: 10 U/mL de superóxido dismutase (SOD) serão então adicionados ao Amplex UltraRed/HRP contendo perfusatos. Três amostras de dialisato de vinte minutos serão coletadas nos 60 minutos subsequentes para fornecer medições dos efeitos de SNP, 1 mM de apocinina, 100nM MitoTempo, 100uM MitoTempo+Apocinina, 100nM GKT 137831 ou 100nM GKT 137831+Apocinina na ausência de SOD. Fase 4: As soluções de perfusato nas sondas de dois a sete serão alteradas para conter a solução de controle mais 50 mM de Ach (para determinar alterações dependentes do endotélio) ou 50 mM de ACh + 1 mM de apocinina, 100 nM MitoTempo, 100uM MitoTempo+ Apocinina, 100nM GKT 137831 ou 100nM GKT 137831+Apocinina (para determinar se a inibição da NADPH oxidase ou a produção de ROS mitocondrial melhora a resposta dependente do endotélio). As sondas serão perfundidas por 60 minutos para permitir o equilíbrio com o ambiente local. Três amostras de dez minutos serão coletadas nos 30 minutos subsequentes para determinar os efeitos do fluxo nutritivo de ACH na presença e ausência de NADPH oxidase ou inibição de ROS mitocondrial. Para cada amostra em que Amplex UltraRed e HRP são adicionados ao meio de perfusão, 30 µL de dialisato serão medidos imediatamente para H2O2 no fluorômetro de laboratório. Para cada amostra em que o fluxo sanguíneo é medido, o dialisato será armazenado a 4 °C e analisado para etanol (para fluxo sanguíneo/troca microvascular) dentro de 24 horas. Todos os perfundidos e dialisados ​​serão protegidos da exposição à luz.

Taxa de entrada/saída de etanol de microdiálise O etanol (5 mM) será incluído no meio de perfusão para monitorar o fluxo sanguíneo nutritivo/troca microvascular na área da sonda de microdiálise, conforme descrito em nossas publicações anteriores 30-32.

Determinação da capacidade aeróbica máxima (antes e depois do treinamento físico):

Todos os indivíduos realizarão um teste de exercício máximo padronizado em uma esteira após a inscrição no estudo e novamente após a conclusão do programa de treinamento. Os participantes ajustarão individualmente a velocidade e a inclinação (3-6 km·h-1, 0-5%) por um período de aquecimento de 5 minutos. Após o período de aquecimento, o O2 e o CO2 expirados do sujeito serão monitorados continuamente por meio de espirometria de circuito aberto (TrueOne 2400; Parvomedics; Salt Lake City, UT). O teste de VO2pico será realizado utilizando um protocolo de rampa onde a velocidade será constante e a inclinação será aumentada 2% a cada dois minutos até atingir o VO2pico. A velocidade inicial será ajustada individualmente com base nas velocidades de aquecimento e frequências cardíacas, com a intenção de obter o VO2pico em 8-12 minutos.

Protocolo de treinamento Todos os participantes realizarão treinamento aeróbico intervalado três vezes por semana em dias não consecutivos durante oito semanas. O exercício consistirá em caminhar/subir uma inclinação em uma esteira. Os indivíduos aquecerão por 10 minutos a 70% da frequência cardíaca máxima (FCmáx conforme determinado durante o teste de VO2pico) antes de realizar quatro intervalos de 4 minutos a 90% da FCmáx com uma recuperação ativa de 3 minutos a 70% da FCmáx entre intervalos e um período de resfriamento de 5 minutos, resultando em um tempo total de exercício de 40 minutos.

Determinação da composição corporal A massa isenta de gordura, a massa gorda e o percentual de gordura corporal serão determinados usando absorciometria de raios X de dupla energia (DXA; GE Lunar Prodigy Advance, Madison WI). A massa corporal e a estatura serão mensuradas para cálculo do índice de massa corporal (IMC: kg/m2). As circunferências mínima da cintura e máxima do quadril também serão medidas para potencialmente serem usadas como uma covariável em análises estatísticas devido à relação da relação peso/altura e circunferência da cintura com risco de doença cardiometabólica.

Marcadores musculares de estresse oxidativo:

As biópsias serão, portanto, realizadas no estado de repouso antes e depois do treinamento nos participantes que concordam com o procedimento de biópsia. Biópsias musculares percutâneas serão obtidas do vasto lateral do grupo muscular quadríceps femoral (sofre adaptações ao treinamento físico proposto) por procedimentos estéreis e após administração de anestesia local (lidocaína a 1%).