Микроваскулярная дисфункция при ожирении

Двадцать пять мужчин и женщин (18–45 лет) с ожирением 2-й степени и выше [индекс массы тела (ИМТ) >35 кг/м2, окружность талии >40 дюймов (мужчины) или >35 дюймов (женщины)] эти эксперименты. Лица моложе 18 лет не будут исследованы из-за инвазивного характера протокола. Лица старше 45 лет не будут исследованы из-за возрастного снижения функции эндотелия. Не будет никаких ограничений в отношении расы, пола или социально-экономического статуса. Женщины будут в пременопаузе, будут получать комбинированную эстроген/прогестиновую гормональную контрацептивную терапию (пероральные таблетки, трансдермальный пластырь или вагинальное кольцо) и будут изучаться в течение семидневной неактивной (плацебо) фазы гормональной контрацептивной терапии (сопоставимой с ранней фолликулярной фазой в нормальный менструальный цикл, подтвержденный анализом крови на эстрадиол). Обеспечение последовательности в исследовании женщин во время фазы гормональной контрацептивной терапии с самыми низкими концентрациями эстрадиола в плазме важно из-за известных положительных эффектов эстрадиола на функцию эндотелия. Лица с малоподвижным образом жизни с ожирением будут иметь стабильный вес в течение предшествующих 6 месяцев и будут иметь метаболический синдром. Метаболический синдром будет определяться в соответствии с наиболее широко используемыми критериями метаболического синдрома из Третьего отчета группы экспертов Национальной образовательной программы по холестерину по выявлению, оценке и лечению высокого уровня холестерина в крови у взрослых (Группа лечения взрослых III). Лица с метаболическим синдромом имеют как минимум три из следующих признаков: 1) центральное ожирение, измеряемое по окружности талии (мужчины> 40 дюймов; женщины> 35 дюймов); 2) Триглицериды крови натощак > 150 мг/дл; 3) уровень холестерина ЛПВП в крови у мужчин <40 мг/дл и у женщин <50 мг/дл; 4) артериальное давление > 130/85 мм рт.ст.; 5) Глюкоза крови натощак > 110 мг/дл и (не по ATP III) 2-часовая GTT-глюкоза 140-200 мг/дл.

Перед участием в этом исследовании испытуемые пройдут сбор анамнеза, медицинский осмотр и скрининг на наличие сердечно-сосудистых заболеваний и диабета 2 типа. Оценка состоит из дифференцированного стресс-теста на беговой дорожке, биохимического анализа крови, анализа состава тела с помощью двойной рентгеновской абсорбциометрии (DXA) и измерения минимальной окружности талии (между мечевидным отростком и пупком).

Исключения Субъекты, участвующие в целенаправленных тренировках на выносливость (> 20 минут в день,> 1 дня в неделю), будут исключены. Субъекты женского пола в пременопаузе не должны быть беременными или кормящими грудью и должны иметь регулярные менструальные циклы в течение последнего года. Все субъекты будут обследованы на наличие сердечно-сосудистых и периферических сосудистых заболеваний. Лица, принимающие лекарства, которые могут повлиять на центральное или периферическое кровообращение, принимающие нестероидные противовоспалительные средства или ингибиторы обратного захвата серотонина, курящие или жующие табак, страдающие диабетом (глюкоза крови натощак >125 мг/дл), гипертонией >160/95 мм рт. с диабетом и высокой степенью артериальной гипертензии будут исключены, чтобы сохранить более однородную группу лиц с метаболическим синдромом), застойной сердечной недостаточностью, стенокардией или заболеванием периферических сосудов. Лица с признаками серьезных аритмий и/или острой ишемии миокарда, выражающейся в депрессии сегмента ST на 1 мм или более в покое или во время физической нагрузки, будут исключены. Лица с хроническими инфекциями, параличом из-за инсульта, прогрессирующей болезнью Паркинсона, тяжелым ревматоидным артритом или другими серьезными ортопедическими проблемами, которые могут помешать выполнению упражнений, будут исключены. Субъектам не разрешается принимать антиоксиданты, растительные или витаминные добавки как минимум за 2 недели до исследования, поскольку было показано, что некоторые из этих агентов улучшают эндотелий-зависимую вазодилатацию. Субъектам не разрешается употреблять кофеин в день эксперимента. Субъекты будут исключены, если вес изменится более чем на 5% во время программы тренировок или если их приверженность упражнениям будет ниже 90% сеансов упражнений или общего времени упражнений.

Сроки: Субъекты будут набраны, проверены, зачислены и протестированы в течение месяцев 3-28 этого гранта. Процедуры найма субъектов и закупки необходимых материалов будут происходить в течение первых 2 месяцев проекта. Дополнительный набор, а также скрининг и тестирование субъектов будут происходить циклами в 1 месяц в течение следующих 25 месяцев со скоростью примерно 1 человек за цикл. Таким образом, на участниках будет проведено 25 экспериментов по микродиализу как до, так и после 8 недель тренировок, всего 50 экспериментов по микродиализу. Таким образом, этот план потребует в среднем 2 тестов микродиализа в месяц в течение месяцев тестирования. Тестирование этих субъектов включает шесть часов процедуры микродиализа. Биохимический анализ образцов требует примерно шести часов на эксперимент, а обработка данных еще пять часов на эксперимент. Дополнительное время (пять часов в неделю) требуется для набора испытуемых, предварительного тестирования и последующего наблюдения. Таким образом, цели набора и тестирования реалистичны в свете выделенного персонала и процентной доли усилий в сочетании с персоналом и ресурсами, не включенными в грант.

Микродиализ (до и после тренировки):

Субъекты отправятся в лабораторию Хикнера после ночного голодания. Пока субъекты спокойно отдыхают, из локтевой вены в течение ночи натощак берут кровь для анализа на традиционные (инсулин, глюкоза, липиды, С-реактивный белок) и нетрадиционные [(цитокины ФНО-альфа, ИЛ-6, IL-13, молекула межклеточной адгезии-1 (ICAM-1), молекула сосудистой адгезии-1 (VCAM-1) и P-селектин] маркеры риска сердечно-метаболических заболеваний/воспалительных заболеваний в крови с использованием ИФА от EMD Millipore или нашего клинического анализатора (Системы доступа Beckman). Кроме того, глутатион плазмы (GSH/GSSG) будет проанализирован как маркер системного окислительного стресса с использованием набора от Percipio Biosciences (Bioxytech GSH/GSSG).

Процедура микродиализа Семь микродиализных зондов (CMA 20: 10 мм * 0,5 мм, отсечной мембраной 20 килодальтон, длина стержня зонда 5 см, входная трубка и выходная трубка 20 см; CMA/Microdialysis, Стокгольм, Швеция) будут чрескожно вставлены на расстоянии 3 см друг от друга в широкую мышцу бедра. lateralis группы четырехглавой мышцы бедра (3-4 зонда на ногу) стерильным способом под местной анестезией (1% лидокаин). Зонды будут перфузированы соответствующим раствором со скоростью 2,0 мкл/мин с использованием микроинфузионных насосов CMA/102 (CMA/Microdialysis, Стокгольм, Швеция) в соответствии с графиком, приведенным в таблице 2.

Контрольный перфузионный раствор будет состоять из стерильного физиологического раствора, содержащего 5 мМ этанола (для измерения кровотока/микрососудистого обмена). Сначала два зонда будут перфузированы этим контрольным раствором, а другие зонды будут перфузированы ингибиторами НАДФН-оксидазы. Субъекты будут отдыхать в сидячем положении в течение 60 минут, чтобы обеспечить восстановление после введения зонда и уравновешивание перфузата местной средой. Фаза 1: три 10-минутных образца диализата будут собраны в течение последующих 30 минут в полиэтиленовые флаконы для сбора проб емкостью 150 мкл для определения основного пищевого потока в отсутствие (зонд 1) и в присутствии (зонды 3-7) ингибиторов НАДФН-оксидазы. и служить в качестве контрольного периода внутри зонда перед перфузией SNP (зонд 2). Фаза 2: растворы перфузата во втором зонде затем будут заменены на контрольный раствор плюс 50 мМ нитропруссида натрия (SNP: для контроля изменений, не зависящих от эндотелия). 100 мкМ Amplex UltraRed и 1 ЕД/мл пероксидазы хрена (HRP) будут добавлены к перфузату других зондов для измерения продукции H2O2 in vivo. Затем в течение последующих 60 минут берут три двадцатиминутных образца диализата, чтобы обеспечить эти измерения в отсутствие супероксиддисмутазы. Фаза 3: 10 ЕД/мл супероксиддисмутазы (СОД) затем добавляют к перфузатам, содержащим Amplex UltraRed/HRP. Затем в течение последующих 60 минут будут взяты три двадцатиминутных образца диализата для измерения эффектов SNP, 1 мМ апоцинина, 100 нМ MitoTempo, 100 мМ MitoTempo+апоцинина, 100 нМ GKT 137831 или 100 нМ GKT 137831+апоцинина в отсутствие СОД. Фаза 4: растворы перфузата в зондах со второго по седьмой затем будут заменены на контрольный раствор плюс либо 50 мМ АХ (для определения эндотелийзависимых изменений), либо 50 мМ АХ + 1 мМ апоцинина, 100 нМ MitoTempo, 100 мМ MitoTempo+. Апоцинин, 100 нМ GKT 137831 или 100 нМ GKT 137831 + апоцинин (чтобы определить, улучшает ли ингибирование НАДФН-оксидазы или продукции митохондриальных АФК эндотелий-зависимый ответ). Затем зонды будут подвергаться перфузии в течение 60 минут, чтобы обеспечить уравновешивание с местной средой. Затем в течение последующих 30 минут будут взяты три десятиминутных образца для определения влияния АХГ на питательный поток в присутствии и в отсутствие ингибирования НАДФН-оксидазы или митохондриального АФК. Для каждого образца, в который Amplex UltraRed и HRP добавляются в перфузионную среду, 30 мкл диализата будут немедленно измерены на H2O2 лабораторным флуорометром. Для каждого образца, в котором измеряется кровоток, диализат будет храниться при 4 °C и анализироваться на этанол (по кровотоку/микрососудистому обмену) в течение 24 часов. Все перфузаты и диализаты будут защищены от воздействия света.

Соотношение оттока/притока этанола при микродиализе Этанол (5 мМ) будет включен в перфузионную среду для мониторинга питательного кровотока/микрососудистого обмена в области микродиализного зонда, как описано в наших предыдущих публикациях 30-32.

Определение пиковой аэробной способности (до и после тренировки):

Все испытуемые будут выполнять стандартизированный тест максимальной физической нагрузки на беговой дорожке после включения в исследование и повторно после завершения программы обучения. Субъекты будут индивидуально регулировать скорость и наклон (3-6 км·ч-1, 0-5%) в течение 5-минутного периода разминки. После периода разогрева выдыхаемый субъектом O2 и CO2 будет непрерывно контролироваться с помощью спирометрии открытого цикла (TrueOne 2400; Parvomedics; Солт-Лейк-Сити, Юта). Тест VO2peak будет выполняться с использованием протокола рампы, при котором скорость будет постоянной, а наклон будет увеличиваться на 2% каждые две минуты, пока не будет достигнут VO2peak. Начальная скорость будет индивидуально регулироваться в зависимости от скорости разминки и частоты сердечных сокращений с целью достижения VO2peak в течение 8-12 минут.

Протокол тренировок Все участники будут выполнять аэробные интервальные тренировки три раза в неделю в непоследовательные дни в течение восьми недель. Упражнение будет состоять из ходьбы/бега по склону на беговой дорожке. Субъекты будут разогреваться в течение 10 минут при 70% максимальной частоты сердечных сокращений (HRmax, как определено во время теста VO2peak) перед выполнением четырех 4-минутных интервалов при 90% HRmax с 3-минутным активным восстановлением при 70% HRmax между интервалами и 5-минутный период заминки, в результате чего общее время упражнения составляет 40 минут.

Определение состава тела Безжировая масса, жировая масса и процентное содержание жира в организме будут определяться с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DXA; GE Lunar Prodigy Advance, Мэдисон, Висконсин). Масса тела и рост будут измерены для расчета индекса массы тела (ИМТ: кг/м2). Также будут измеряться минимальная окружность талии и максимальная окружность бедер, которые потенциально могут быть использованы в качестве ковариации в статистическом анализе из-за взаимосвязи соотношения веса и высоты и окружности талии с риском сердечно-метаболических заболеваний.

Мышечные маркеры окислительного стресса:

Поэтому биопсии будут взяты в состоянии покоя до и после обучения тех участников, которые согласились на процедуру биопсии. Биопсия чрескожных мышц будет получена из латеральной широкой мышцы группы четырехглавой мышцы бедра (претерпевает адаптацию к предлагаемой физической нагрузке) с использованием стерильных процедур и после введения местной анестезии (1% лидокаина).