Zaburzenia mikrokrążenia w otyłości

Dwudziestu pięciu prowadzących siedzący tryb życia otyłych klasy 2 i powyżej [wskaźnik masy ciała (BMI) >35 kg/m2, obwód talii >40 cali (mężczyźni) lub >35 cali (kobiety)] mężczyzn i kobiet (18-45 lat) wezmą udział w te eksperymenty. Osoby poniżej 18 roku życia nie będą badane ze względu na inwazyjny charakter protokołu. Osoby w wieku powyżej 45 lat nie będą badane ze względu na związany z wiekiem spadek funkcji śródbłonka. Nie będzie żadnych ograniczeń dotyczących rasy, płci ani statusu społeczno-ekonomicznego. Kobiety będą przed menopauzą, będą stosować złożone hormonalne środki antykoncepcyjne zawierające estrogen i progestagen (tabletki doustne, plastry przezskórne lub krążki dopochwowe) i będą badane w siedmiodniowej fazie nieaktywnej (placebo) hormonalnej terapii antykoncepcyjnej (porównywalnej z wczesną fazą folikularną w prawidłowy cykl menstruacyjny; potwierdzony analizą estradiolu we krwi). Zapewnienie konsekwencji w badaniu kobiet w fazie hormonalnej antykoncepcji z najniższymi stężeniami estradiolu w osoczu jest ważne ze względu na znany pozytywny wpływ estradiolu na funkcję śródbłonka. Osoby otyłe prowadzące siedzący tryb życia będą miały stabilną wagę przez ostatnie 6 miesięcy i będą miały zespół metaboliczny. Zespół metaboliczny zostanie zdefiniowany zgodnie z najszerzej stosowanymi kryteriami zespołu metabolicznego z Trzeciego Raportu Zespołu Ekspertów Narodowego Programu Edukacji Cholesterolowej ds. Osoby z zespołem metabolicznym mają co najmniej trzy z następujących cech: 1) otyłość centralną mierzoną na podstawie obwodu talii (mężczyźni >40 cali; kobiety >35 cali); 2) trójglicerydy we krwi na czczo > 150 mg/dl; 3) Cholesterol HDL we krwi u mężczyzn <40 mg/dL i kobiet <50 mg/dL; 4) Ciśnienie krwi > 130/85 mmHg; 5) Stężenie glukozy we krwi na czczo > 110 mg/dl i (nie według ATP III) 2-godzinny GTT 140-200 mg/dl.

Przed wzięciem udziału w tym badaniu uczestnicy zostaną poddani wywiadowi medycznemu, badaniu fizykalnemu oraz badaniom przesiewowym w kierunku chorób układu krążenia i cukrzycy typu 2. Oceny obejmują stopniowany test wysiłkowy na bieżni, badanie biochemiczne krwi, analizę składu ciała za pomocą podwójnej absorpcjometrii rentgenowskiej (DXA) oraz pomiar minimalnego obwodu talii (między wyrostkiem mieczykowatym a pępkiem).

Wykluczenia Osoby biorące udział w celowym treningu wytrzymałościowym (>20 min/dzień, >1 dzień/tydzień) zostaną wykluczone. Kobiety przed menopauzą nie mogą być w ciąży ani karmić piersią i muszą mieć regularne cykle miesiączkowe przez ostatni rok. Wszyscy uczestnicy zostaną przebadani pod kątem chorób układu krążenia i naczyń obwodowych. Osoby przyjmujące leki mogące wpływać na krążenie centralne lub obwodowe, stosujące niesteroidowe leki przeciwzapalne lub inhibitory wychwytu zwrotnego serotoniny, palące lub żujące tytoń, chore na cukrzycę (glikemia na czczo >125 mg/dl), nadciśnienie tętnicze >160/95 mmHg (osoby z cukrzycą i wysokim stopniem nadciśnienia będą wykluczeni, aby zachować bardziej jednorodną grupę osób z zespołem metabolicznym), zastoinową niewydolność serca, dusznicę bolesną lub chorobę naczyń obwodowych. Osoby z objawami poważnych zaburzeń rytmu i/lub ostrego niedokrwienia mięśnia sercowego przejawiające się obniżeniem odcinka ST o 1 mm lub więcej w spoczynku lub podczas wysiłku zostaną wykluczone. Osoby z przewlekłymi infekcjami, porażeniem udarowym, zaawansowaną chorobą Parkinsona, ciężkim reumatoidalnym zapaleniem stawów lub innymi poważnymi problemami ortopedycznymi uniemożliwiającymi wykonywanie zadań z zakresu treningu wysiłkowego zostaną wykluczone. Osobnikom nie wolno przyjmować suplementów zawierających przeciwutleniacze, zioła lub witaminy przez co najmniej 2 tygodnie przed badaniem, ponieważ wykazano, że niektóre z tych środków poprawiają zależne od śródbłonka rozszerzenie naczyń. Badani nie będą mogli spożywać kofeiny w dniu eksperymentu. Uczestnicy zostaną wykluczeni, jeśli waga zmieni się o więcej niż 5% podczas programu treningowego lub jeśli ich przestrzeganie ćwiczeń spadnie poniżej 90% sesji ćwiczeń lub całkowitego czasu ćwiczeń.

Ramy czasowe: Przedmioty będą rekrutowane, sprawdzane, rejestrowane i testowane w miesiącach 3-28 tego grantu. Procedury rekrutacji przedmiotów i zaopatrzenia w potrzebne materiały będą miały miejsce w ciągu pierwszych 2 miesięcy trwania projektu. Dodatkowa rekrutacja, a także badania przesiewowe i testowanie uczestników będą odbywać się w cyklach 1-miesięcznych w ciągu następnych 25 miesięcy w tempie około 1 na cykl. Dwadzieścia pięć eksperymentów mikrodializy zostanie zatem przeprowadzonych na uczestnikach zarówno przed, jak i po 8 tygodniach treningu fizycznego, w sumie 50 eksperymentów mikrodializy. Plan ten będzie zatem wymagał średnio 2 testów mikrodializy miesięcznie w miesiącach testowych. Badanie tych osób obejmuje sześć godzin procedury mikrodializy. Analiza biochemiczna próbek wymaga około sześciu godzin na eksperyment, a redukcja danych o kolejne pięć godzin na eksperyment. Wymagany jest dodatkowy czas (pięć godzin tygodniowo) na rekrutację uczestników, wstępne testy i działania następcze. Cele rekrutacji i testowania są zatem realistyczne w świetle przydzielonego personelu i procentowego wysiłku, w połączeniu z personelem i zasobami nieobciążonymi dotacją.

Mikrodializa (przed i po treningu fizycznym):

Badani zgłaszają się do laboratorium Hicknera po nocnym poście. Kiedy badani spokojnie odpoczywają, z żyły odłokciowej zostanie pobrana krew na czczo w ciągu nocy w celu analizy pod kątem tradycyjnych (insulina, glukoza, lipidy, białko c-reaktywne) i nietradycyjnych [(cytokiny TNF-alfa, IL-6, IL-13, cząsteczka adhezji międzykomórkowej-1 (ICAM-1), cząsteczka adhezji naczyniowej-1 (VCAM-1) i selektyna P] markery ryzyka chorób sercowo-metabolicznych/zapalnych we krwi przy użyciu testu ELISA firmy EMD Millipore lub naszego analizatora klinicznego (systemy dostępowe Beckmana). Ponadto glutation w osoczu (GSH/GSSG) będzie analizowany jako marker ogólnoustrojowego stresu oksydacyjnego przy użyciu zestawu firmy Percipio Biosciences (Bioxytech GSH/GSSG).

Procedura mikrodializy Siedem sond do mikrodializy (CMA 20: membrana odcinająca 10 mm * 0,5 mm 20 kilodaltonów, długość trzonu sondy 5 cm, rurki wlotowe i rurki wylotowe 20 cm; CMA/Mikrodializa, Sztokholm, Szwecja) zostanie wprowadzonych przezskórnie, w odległości 3 cm, do obszernego lateralis grupy mięśnia czworogłowego uda (3-4 sondy na nogę) stosując sterylną technikę w znieczuleniu miejscowym (1% lidokaina). Sondy będą perfundowane odpowiednim roztworem z szybkością 2,0 µl/min przy użyciu pomp mikroinfuzyjnych CMA/102 (CMA/Microdialysis, Sztokholm, Szwecja) zgodnie z harmonogramem w Tabeli 2.

Kontrolny roztwór do perfuzji będzie składał się ze sterylnego roztworu soli zawierającego 5 mM etanolu (do pomiarów przepływu krwi/wymiany mikrokrążenia). Dwie z sond zostaną początkowo poddane perfuzji tym roztworem kontrolnym, podczas gdy inne sondy zostaną poddane perfuzji inhibitorami oksydazy NADPH. Pacjenci będą odpoczywać w pozycji siedzącej przez 60 minut, aby umożliwić powrót do zdrowia po wprowadzeniu sondy i zrównoważeniu perfuzatu z lokalnym środowiskiem. Faza 1: Trzy 10-minutowe próbki dializatu zostaną zebrane w ciągu kolejnych 30 minut do zakorkowanych polietylenowych fiolek do pobierania o pojemności 150 µl w celu określenia podstawowego przepływu składników odżywczych przy nieobecności (sonda 1) i obecności (sondy 3-7) inhibitorów oksydazy NADPH, i służyć jako okres kontrolny wewnątrz sondy przed perfuzją SNP (sonda 2). Faza 2: Roztwory perfuzatu w drugiej sondzie zostaną następnie zmienione tak, aby zawierały roztwór kontrolny plus 50 mM nitroprusydek sodu (SNP: kontrola zmian niezależnych od śródbłonka). 100 µM Amplex UltraRed i 1 U/ml peroksydazy chrzanowej (HRP) zostaną dodane do perfuzatu w innych sondach w celu pomiaru produkcji H2O2 in vivo. Trzy dwudziestominutowe próbki dializatu zostaną następnie zebrane w ciągu następnych 60 minut, aby zapewnić te pomiary przy braku dysmutazy ponadtlenkowej. Faza 3: Następnie do perfuzatów zawierających Amplex UltraRed/HRP zostanie dodane 10 U/ml dysmutazy ponadtlenkowej (SOD). Trzy dwudziestominutowe próbki dializatu zostaną następnie zebrane w ciągu kolejnych 60 minut, aby zapewnić pomiary wpływu SNP, 1 mM apocyniny, 100 nM MitoTempo, 100 uM MitoTempo + Apocynin, 100 nM GKT 137831 lub 100 nM GKT 137831 + apocynina przy braku DARŃ. Faza 4: Roztwory perfuzatu w sondach od drugiego do siódmego zostaną następnie zmienione tak, aby zawierały roztwór kontrolny plus 50 mM Ach (w celu określenia zmian zależnych od śródbłonka) lub 50 mM ACh + albo 1 mM apocynina, 100 nM MitoTempo, 100 µM MitoTempo+ Apocynina, 100nM GKT 137831 lub 100nM GKT 137831+Apocynina (w celu określenia, czy hamowanie oksydazy NADPH lub mitochondrialnego wytwarzania ROS poprawia odpowiedź zależną od śródbłonka). Sondy będą następnie poddawane perfuzji przez 60 minut, aby umożliwić zrównoważenie z lokalnym środowiskiem. Trzy dziesięciominutowe próbki zostaną następnie zebrane w ciągu kolejnych 30 minut w celu określenia wpływu ACH na przepływ składników odżywczych w obecności i przy braku hamowania oksydazy NADPH lub mitochondrialnego ROS. Dla każdej próbki, do której Amplex UltraRed i HRP zostaną dodane do podłoża perfuzyjnego, 30 µl dializatu zostanie natychmiast zmierzone na zawartość H2O2 w laboratoryjnym fluorometrze. W przypadku każdej próbki, w której mierzony jest przepływ krwi, dializat będzie przechowywany w temperaturze 4°C i analizowany pod kątem zawartości etanolu (pod kątem przepływu krwi/wymiany mikrokrążenia) w ciągu 24 godzin. Wszystkie perfuzaty i dializaty będą chronione przed działaniem światła.

Stosunek odpływ/dopływ etanolu do mikrodializy Etanol (5 mM) zostanie dodany do podłoża perfuzyjnego w celu monitorowania przepływu krwi odżywczej/wymiany mikronaczyniowej w obszarze sondy do mikrodializy, jak opisano w naszych poprzednich publikacjach 30-32.

Określenie szczytowej wydolności tlenowej (przed i po treningu wysiłkowym):

Po włączeniu do badania i ponownie po zakończeniu programu treningowego wszyscy uczestnicy wykonają standaryzowaną próbę wysiłkową na bieżni. Badani indywidualnie dostosują prędkość i nachylenie (3-6 km·h-1, 0-5%) przez 5-minutowy okres rozgrzewki. Po okresie rozgrzewki wydychane O2 i CO2 pacjenta będą stale monitorowane za pomocą spirometrii z obiegiem otwartym (TrueOne 2400; Parvomedics; Salt Lake City, UT). Test VO2peak zostanie przeprowadzony przy użyciu protokołu rampy, w którym prędkość będzie stała, a nachylenie będzie zwiększane o 2% co dwie minuty, aż do osiągnięcia VO2peak. Prędkość początkowa zostanie indywidualnie dostosowana na podstawie prędkości rozgrzewki i tętna, z zamiarem uzyskania VO2peak w ciągu 8-12 minut.

Protokół treningowy Wszyscy uczestnicy będą wykonywać aerobowe ćwiczenia interwałowe trzy razy w tygodniu w nienastępujące po sobie dni przez osiem tygodni. Ćwiczenie będzie polegało na marszu/bieganiu po pochylni na bieżni. Badani będą rozgrzewać się przez 10 minut przy 70% maksymalnego tętna (HRmax określone podczas testu VO2peak) przed wykonaniem czterech 4-minutowych interwałów przy 90% HRmax z 3-minutową aktywną regeneracją przy 70% HRmax pomiędzy interwałami i 5-minutowy okres schładzania, co daje całkowity czas ćwiczeń wynoszący 40 minut.

Określenie składu ciała Masę beztłuszczową, masę tkanki tłuszczowej i procent tkanki tłuszczowej określa się za pomocą absorpcjometrii rentgenowskiej o podwójnej energii (DXA; GE Lunar Prodigy Advance, Madison WI). Masa ciała i wzrost zostaną zmierzone w celu obliczenia wskaźnika masy ciała (BMI: kg/m2). Mierzone będą również minimalne obwody talii i maksymalne biodra, aby potencjalnie można je było wykorzystać jako współzmienną w analizach statystycznych ze względu na związek stosunku w/h i obwodu talii z ryzykiem chorób sercowo-metabolicznych.

Markery mięśniowe stresu oksydacyjnego:

Biopsje będą zatem pobierane w stanie spoczynku przed i po szkoleniu od tych uczestników, którzy wyrażą zgodę na procedurę biopsji. Przezskórne biopsje mięśni będą pobierane z mięśnia obszernego bocznego grupy mięśnia czworogłowego uda (przechodzi adaptację do proponowanego treningu wysiłkowego) z zastosowaniem procedur sterylnych i po podaniu znieczulenia miejscowego (lidokaina 1%).