Disfunzione microvascolare nell'obesità

Venticinque sedentari di classe 2 e superiori obesi [indice di massa corporea (BMI) >35 kg/m2, circonferenza della vita >40 pollici (uomini) o >35 pollici (donne)] uomini e donne (18-45 anni) parteciperanno a questi esperimenti. Gli individui di età inferiore ai 18 anni non saranno indagati a causa della natura invasiva del protocollo. Gli individui di età superiore a 45 anni non saranno studiati a causa del declino correlato all'età della funzione endoteliale. Non ci saranno restrizioni per quanto riguarda la razza, il sesso o lo stato socioeconomico. Le donne saranno in premenopausa, saranno in terapia contraccettiva ormonale combinata estrogeno/progestinico (pillola orale, cerotto transdermico o anello vaginale) e saranno studiate entro la fase inattiva di sette giorni (placebo) della terapia contraccettiva ormonale (paragonabile alla fase follicolare precoce in il normale ciclo mestruale; verificato mediante analisi di estradiolo nel sangue). Garantire la coerenza nello studio delle donne durante la fase della terapia contraccettiva ormonale con le più basse concentrazioni plasmatiche di estradiolo è importante a causa dei noti effetti positivi dell'estradiolo sulla funzione endoteliale. Gli individui obesi sedentari avranno un peso stabile nei 6 mesi precedenti e avranno la sindrome metabolica. La sindrome metabolica sarà definita secondo i criteri più ampiamente utilizzati per la sindrome metabolica dal terzo rapporto del gruppo di esperti del programma nazionale di educazione al colesterolo sul rilevamento, la valutazione e il trattamento del colesterolo alto negli adulti (gruppo di trattamento degli adulti III). Gli individui con la sindrome metabolica hanno almeno tre dei seguenti: 1) obesità centrale misurata dalla circonferenza della vita (uomini > 40 pollici; donne > 35 pollici); 2) Trigliceridi ematici a digiuno > 150 mg/dL; 3) Colesterolo HDL nel sangue negli uomini <40 mg/dL e nelle donne <50 mg/dL; 4) Pressione arteriosa > 130/85 mmHg; 5) Glicemia a digiuno > 110 mg/dL e (non per ATP III) una glicemia GTT a 2 ore di 140-200 mg/dl.

Prima di partecipare a questo studio, i soggetti saranno sottoposti a anamnesi, esame fisico e screening per malattie cardiovascolari e diabete di tipo 2. Le valutazioni consistono in un test di stress graduato su tapis roulant, un esame chimico del sangue, un'analisi della composizione corporea mediante Dual X-ray Absorptiometry (DXA) e una misura della circonferenza minima della vita (tra il processo xifoideo e l'ombelico).

Esclusioni Saranno esclusi i soggetti che partecipano ad allenamenti mirati di esercizi di resistenza (>20 min/giorno, >1 giorno/settimana). Le donne in pre-menopausa non devono essere in gravidanza o in allattamento e devono aver avuto cicli mestruali regolari nell'ultimo anno. Tutti i soggetti saranno sottoposti a screening per malattie cardiovascolari e vascolari periferiche. Individui che assumono farmaci che possono influire sulla circolazione centrale o periferica, assumono agenti antinfiammatori non steroidei o inibitori della ricaptazione della serotonina, fumano o masticano tabacco, soffrono di diabete (glicemia a digiuno >125 mg/dL), ipertensione >160/95 mmHg (individui con diabete e alto grado di ipertensione saranno esclusi per mantenere un gruppo più uniforme di individui con la sindrome metabolica), insufficienza cardiaca congestizia, angina o malattia vascolare periferica. Saranno esclusi gli individui con evidenza di gravi aritmie e/o ischemia miocardica acuta riflessa nella depressione del segmento ST di 1 mm o superiore a riposo o durante l'esercizio. Saranno esclusi gli individui con infezioni croniche, paralisi dovute a ictus, morbo di Parkinson avanzato, grave artrite reumatoide o altri gravi problemi ortopedici che impedirebbero l'esecuzione delle attività di allenamento fisico. I soggetti non potranno assumere supplementi di antiossidanti, erbe o vitamine per almeno 2 settimane prima dell'indagine poiché è stato dimostrato che alcuni di questi agenti migliorano la vasodilatazione endotelio-dipendente. I soggetti non potranno ingerire caffeina il giorno dell'esperimento. I soggetti saranno esclusi se il peso cambia di oltre il 5% durante il programma di allenamento o se la loro aderenza all'esercizio è inferiore al 90% delle sessioni di allenamento o del tempo totale di esercizio.

Tempistica: i soggetti saranno reclutati, selezionati, iscritti e testati durante i mesi 3-28 di questa sovvenzione. Le procedure di reclutamento dei soggetti e l'approvvigionamento delle forniture necessarie avverranno durante i primi 2 mesi del progetto. Il reclutamento aggiuntivo, nonché lo screening e il test dei soggetti avverranno in cicli di 1 mese nei successivi 25 mesi a una velocità di circa 1 per ciclo. Verranno quindi eseguiti venticinque esperimenti di microdialisi sui partecipanti sia prima che dopo 8 settimane di allenamento fisico, per un totale di 50 esperimenti di microdialisi. Questo piano richiederà quindi in media 2 test di microdialisi al mese durante i mesi di test. Il test di questi soggetti comprende sei ore per la procedura di microdialisi. L'analisi biochimica dei campioni richiede circa sei ore per esperimento e la riduzione dei dati di altre cinque ore per esperimento. È richiesto tempo aggiuntivo (cinque ore settimanali) per il reclutamento dei soggetti, i test preliminari e il follow-up. Gli obiettivi di reclutamento e test sono quindi realistici alla luce del personale e delle percentuali di impegno assegnate, unitamente al personale e alle risorse non imputate alla sovvenzione.

Microdialisi (prima e dopo l'allenamento):

I soggetti riferiranno al laboratorio Hickner dopo un digiuno notturno. Mentre i soggetti riposano tranquillamente, verrà effettuato un prelievo di sangue a digiuno notturno da una vena antecubitale da analizzare per tradizionali (insulina, glucosio, lipidi, proteina c-reattiva) e non tradizionali [(citochine TNF-alfa, IL-6, IL-13, molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1), molecola di adesione vascolare-1 (VCAM-1) e P-selectina] marcatori di rischio di malattia cardio-metabolica/infiammatori nel sangue utilizzando ELISA di EMD Millipore o il nostro analizzatore clinico (Sistemi di accesso Beckman). Inoltre, il glutatione plasmatico (GSH/GSSG) sarà analizzato come marcatore di stress ossidativo sistemico utilizzando un kit della Percipio Biosciences (Bioxytech GSH/GSSG).

Procedura di microdialisi Sette sonde per microdialisi (CMA 20: 10 mm * 0,5 mm 20 kilodalton cutoff membrane, 5 cm di lunghezza dell'asta della sonda, tubo di ingresso e tubo di uscita 20 cm; CMA/Microdialisi, Stoccolma, Svezia) verranno inserite per via percutanea, a 3 cm di distanza, nel vasto lateralis del gruppo muscolare del quadricipite femorale (3-4 sonde per gamba) utilizzando una tecnica sterile in anestesia locale (lidocaina all'1%). Le sonde saranno perfuse con la soluzione appropriata a una velocità di 2,0 µL/min utilizzando le pompe per microinfusione CMA/102 (CMA/Microdialisi, Stoccolma, Svezia) secondo il programma nella Tabella 2.

La soluzione di perfusione di controllo consisterà in una soluzione salina sterile contenente 5 mM di etanolo (per le misure di flusso sanguigno/scambio microvascolare). Due delle sonde saranno inizialmente perfuse con questa soluzione di controllo mentre le altre sonde saranno perfuse con inibitori della NADPH ossidasi. I soggetti riposeranno seduti per 60 minuti per consentire il recupero dall'inserimento della sonda e l'equilibrio del perfusato con l'ambiente locale. Fase 1: Tre campioni di dialisato di 10 minuti saranno raccolti nei successivi 30 minuti in fiale di raccolta di polietilene da 150 µL tappate per determinare il flusso nutritivo basale in assenza (sonda 1) e presenza (sonde 3-7) degli inibitori della NADPH ossidasi, e fungere da periodo di controllo intra-sonda prima della perfusione SNP (sonda 2). Fase 2: le soluzioni di perfusato nella seconda sonda verranno quindi modificate per contenere la soluzione di controllo più nitroprussiato di sodio 50 mM (SNP: per controllare i cambiamenti non dipendenti dall'endotelio). 100 µM di Amplex UltraRed e 1 U/mL di perossidasi di rafano (HRP) saranno aggiunti al perfusato nelle altre sonde per misurare la produzione di H2O2 in vivo. Tre campioni di dialisato di venti minuti verranno quindi raccolti nei successivi 60 minuti per fornire queste misure in assenza di superossido dismutasi. Fase 3: 10 U/mL di superossido dismutasi (SOD) verranno quindi aggiunti all'Amplex UltraRed/HRP contenente perfusati. Tre campioni di dialisato di venti minuti verranno quindi raccolti nei successivi 60 minuti per fornire misure degli effetti di SNP, 1 mM apocynin, 100nM MitoTempo, 100uM MitoTempo+Apocynin, 100nM GKT 137831 o 100nM GKT 137831+Apocynin in assenza di ZOLLA ERBOSA. Fase 4: le soluzioni di perfusato nelle sonde da due a sette verranno quindi modificate per contenere la soluzione di controllo più 50 mM Ach (per determinare i cambiamenti dipendenti dall'endotelio) o 50 mM ACh + 1 mM di apocinina, 100 nM MitoTempo, 100 uM MitoTempo + Apocynin, 100nM GKT 137831 o 100nM GKT 137831+Apocynin (per determinare se l'inibizione della NADPH ossidasi o la produzione mitocondriale di ROS migliora la risposta endotelio-dipendente). Le sonde verranno quindi perfuse per 60 minuti per consentire l'equilibrio con l'ambiente locale. Tre campioni di dieci minuti saranno quindi raccolti nei successivi 30 minuti per determinare gli effetti del flusso nutritivo dell'ACH in presenza e in assenza di NADPH ossidasi o inibizione dei ROS mitocondriali. Per ogni campione in cui Ampplex UltraRed e HRP vengono aggiunti al mezzo di perfusione, verranno immediatamente misurati 30 µL di dializzato per H2O2 nel fluorometro da laboratorio. Per ogni campione in cui viene misurato il flusso sanguigno, il dialisato verrà conservato a 4 °C e analizzato per l'etanolo (per flusso sanguigno/scambio microvascolare) entro 24 ore. Tutti i perfusati ei dialisati saranno protetti dall'esposizione alla luce.

Rapporto tra deflusso/afflusso di etanolo da microdialisi L'etanolo (5 mM) sarà incluso nel mezzo di perfusione per monitorare il flusso sanguigno nutritivo/lo scambio microvascolare nell'area della sonda per microdialisi come descritto nelle nostre precedenti pubblicazioni 30-32.

Determinazione della capacità aerobica di picco (prima e dopo l'allenamento):

Tutti i soggetti eseguiranno un test di esercizio massimo standardizzato su un tapis roulant al momento dell'iscrizione allo studio e di nuovo al termine del programma di allenamento. I soggetti regoleranno individualmente la velocità e l'inclinazione (3-6 km·hr-1, 0-5%) per un periodo di riscaldamento di 5 minuti. Dopo il periodo di riscaldamento, l'O2 e la CO2 espirati del soggetto verranno continuamente monitorati tramite spirometria a circuito aperto (TrueOne 2400; Parvomedics; Salt Lake City, UT). Il test VO2peak verrà eseguito utilizzando un protocollo di rampa in cui la velocità sarà costante e l'inclinazione verrà aumentata del 2% ogni due minuti fino al raggiungimento del VO2peak. La velocità iniziale verrà regolata individualmente in base alle velocità di riscaldamento e alla frequenza cardiaca, con l'intenzione di ottenere il VO2peak entro 8-12 minuti.

Protocollo di allenamento Tutti i partecipanti eseguiranno esercizi aerobici a intervalli tre volte alla settimana in giorni non consecutivi per otto settimane. L'esercizio consisterà nel camminare/correre su un pendio su un tapis roulant. I soggetti si riscalderanno per 10 minuti al 70% della frequenza cardiaca massima (FCmax determinata durante il test VO2peak) prima di eseguire quattro intervalli di 4 minuti al 90% della FCmax con un recupero attivo di 3 minuti al 70% della FCmax tra gli intervalli e un periodo di defaticamento di 5 minuti, per un tempo totale di allenamento di 40 minuti.

Determinazione della composizione corporea La massa magra, la massa grassa e la percentuale di grasso corporeo saranno determinate mediante assorbimetria a raggi X a doppia energia (DXA; GE Lunar Prodigy Advance, Madison WI). La massa corporea e l'altezza saranno misurate per il calcolo dell'indice di massa corporea (BMI: kg/m2). Verranno misurate anche le circonferenze minima della vita e massima dell'anca per essere potenzialmente utilizzate come covariata nelle analisi statistiche a causa della relazione del rapporto peso/ora e della circonferenza della vita con il rischio di malattie cardio-metaboliche.

Marcatori muscolari dello stress ossidativo:

Le biopsie saranno quindi prese nello stato di riposo prima e dopo l'allenamento in quei partecipanti che accettano la procedura di biopsia. Le biopsie muscolari percutanee saranno ottenute dal vasto laterale del gruppo muscolare del quadricipite femorale (subisce adattamenti all'esercizio fisico proposto) utilizzando procedure sterili e dopo somministrazione di anestesia locale (lidocaina all'1%).