Disfunción microvascular en la obesidad

Veinticinco sedentarios de clase 2 y obesos superiores [índice de masa corporal (IMC) >35 kg/m2, circunferencia de la cintura >40 pulgadas (hombres) o >35 pulgadas (mujeres)] hombres y mujeres (18-45 años) participarán en estos experimentos. No se investigarán personas menores de 18 años debido a la naturaleza invasiva del protocolo. Las personas mayores de 45 años no serán investigadas debido a la disminución de la función endotelial relacionada con la edad. No habrá restricciones en cuanto a raza, sexo o nivel socioeconómico. Las mujeres serán premenopáusicas, recibirán una terapia anticonceptiva hormonal combinada de estrógeno/progestágeno (píldora oral, parche transdérmico o anillo vaginal) y serán estudiadas dentro de la fase inactiva de siete días (placebo) de la terapia anticonceptiva hormonal (comparable a la fase folicular temprana en el ciclo menstrual normal; verificado por análisis de estradiol en sangre). Es importante garantizar la coherencia en el estudio de las mujeres durante la fase de la terapia anticonceptiva hormonal con las concentraciones plasmáticas de estradiol más bajas debido a los efectos positivos conocidos del estradiol sobre la función endotelial. Los obesos sedentarios habrán tenido un peso estable durante los 6 meses anteriores y tendrán el Síndrome Metabólico. El Síndrome Metabólico se definirá de acuerdo con los criterios más utilizados para el Síndrome Metabólico del Tercer Informe del Panel de Expertos del Programa Nacional de Educación sobre el Colesterol sobre Detección, Evaluación y Tratamiento del Colesterol Sanguíneo Alto en Adultos (Panel de Tratamiento de Adultos III). Las personas con síndrome metabólico tienen al menos tres de los siguientes: 1) Obesidad central medida por la circunferencia de la cintura (hombres >40 pulgadas; mujeres >35 pulgadas); 2) Triglicéridos en sangre en ayunas > 150 mg/dL; 3) Colesterol HDL en sangre en hombres <40 mg/dL y mujeres <50 mg/dL; 4) Presión arterial > 130/85 mmHg; 5) Glucosa en sangre en ayunas > 110 mg/dL, y (no por ATP III) una glucosa GTT de 2 horas de 140-200 mg/dL.

Antes de participar en este estudio, los sujetos se someterán a un historial médico, un examen físico y pruebas de detección de enfermedades cardiovasculares y diabetes tipo 2. Las evaluaciones consisten en una prueba de esfuerzo graduada en cinta rodante, química sanguínea, análisis de composición corporal por Absorciometría Dual de Rayos X (DXA) y una medida mínima de circunferencia de cintura (entre el proceso xifoides y el ombligo).

Exclusiones Se excluirán los sujetos que participen en un entrenamiento de ejercicios de resistencia con propósito (>20 min/día, >1 día/semana). Las mujeres premenopáusicas no deben estar embarazadas ni amamantando y deben haber tenido ciclos menstruales regulares durante el último año. Todos los sujetos serán examinados para enfermedades cardiovasculares y vasculares periféricas. Individuos que toman medicamentos que pueden afectar la circulación central o periférica, toman agentes antiinflamatorios no esteroideos o inhibidores de la recaptación de serotonina, fuman o mascan tabaco, tienen diabetes (glucemia en ayunas >125 mg/dL), hipertensión >160/95 mmHg (individuos con diabetes y alto grado de hipertensión serán excluidos para mantener un grupo más uniforme de individuos con síndrome metabólico), insuficiencia cardíaca congestiva, angina o enfermedad vascular periférica. Se excluirán las personas con evidencia de arritmias graves y/o isquemia miocárdica aguda reflejada en una depresión del segmento ST de 1 mm o más en reposo o durante el ejercicio. Se excluirán las personas con infecciones crónicas, parálisis por accidente cerebrovascular, enfermedad de Parkinson avanzada, artritis reumatoide grave u otros problemas ortopédicos graves que impidan la realización de las tareas de entrenamiento físico. No se permitirá que los sujetos tomen suplementos de antioxidantes, hierbas o vitaminas durante al menos 2 semanas antes de la investigación, ya que se ha demostrado que algunos de estos agentes mejoran la vasodilatación dependiente del endotelio. Los sujetos no podrán ingerir cafeína el día del experimento. Los sujetos serán excluidos si el peso cambia en más del 5 % durante el programa de entrenamiento o si su adherencia al ejercicio es inferior al 90 % de las sesiones de ejercicio o del tiempo total de ejercicio.

Plazo: Los sujetos serán reclutados, evaluados, inscritos y evaluados durante los meses 3-28 de esta subvención. Los procedimientos de contratación de sujetos y la adquisición de los suministros necesarios se realizarán durante los primeros 2 meses del proyecto. El reclutamiento adicional, así como la selección y las pruebas de los sujetos se realizarán en ciclos de 1 mes durante los 25 meses siguientes a una tasa de aproximadamente 1 por ciclo. Por lo tanto, se realizarán veinticinco experimentos de microdiálisis en los participantes antes y después de 8 semanas de entrenamiento físico, para un total de 50 experimentos de microdiálisis. Por lo tanto, este plan requerirá 2 pruebas de microdiálisis por mes en promedio durante los meses de prueba. Las pruebas de estos sujetos incluyen seis horas para el procedimiento de microdiálisis. El análisis bioquímico de muestras requiere aproximadamente seis horas por experimento y la reducción de datos otras cinco horas por experimento. Se requiere tiempo adicional (cinco horas por semana) para el reclutamiento de sujetos, las pruebas preliminares y el seguimiento. Por lo tanto, los objetivos de reclutamiento y prueba son realistas a la luz del personal y el porcentaje de esfuerzos asignados, junto con el personal y los recursos no cargados a la subvención.

Microdiálisis (antes y después del entrenamiento físico):

Los sujetos se presentarán en el laboratorio de Hickner después de un ayuno nocturno. Mientras los sujetos descansan tranquilamente, se obtendrá una extracción de sangre en ayunas durante la noche de una vena antecubital para analizarla en busca de tradicionales (insulina, glucosa, lípidos, proteína c reactiva) y no tradicionales [(citoquinas TNF-alfa, IL-6, IL-13, molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), molécula de adhesión vascular-1 (VCAM-1) y P-selectina] riesgo de enfermedad cardiometabólica/marcadores inflamatorios en sangre mediante ELISA de EMD Millipore o nuestro analizador clínico (Sistemas de acceso Beckman). Además, se analizará el glutatión plasmático (GSH/GSSG) como marcador de estrés oxidativo sistémico utilizando un kit de Percipio Biosciences (Bioxytech GSH/GSSG).

Procedimiento de microdiálisis Se insertarán percutáneamente siete sondas de microdiálisis (CMA 20: membrana de corte de 20 kilodalton de 10 mm * 0,5 mm, longitud del eje de la sonda de 5 cm, tubo de entrada y tubo de salida de 20 cm; CMA/Microdiálisis, Estocolmo, Suecia), con una separación de 3 cm, en el vasto lateralis del grupo muscular cuádriceps femoral (3-4 sondas por pierna) mediante técnica estéril bajo anestesia local (lidocaína al 1%). Las sondas se perfundirán con la solución adecuada a una velocidad de 2,0 µL/min utilizando bombas de microinfusión CMA/102 (CMA/Microdiálisis, Estocolmo, Suecia) según el programa de la Tabla 2.

La solución de perfusión de control consistirá en una solución salina estéril que contenga etanol 5 mM (para medidas de flujo sanguíneo/intercambio microvascular). Inicialmente, dos de las sondas se perfundirán con esta solución de control, mientras que las otras sondas se perfundirán con inhibidores de la NADPH oxidasa. Los sujetos descansarán sentados durante 60 minutos para permitir la recuperación de la inserción de la sonda y el equilibrio de la perfusión con el entorno local. Fase 1: Se recolectarán tres muestras de dializado de 10 minutos durante los siguientes 30 minutos en viales de recolección de polietileno de 150 µL tapados para determinar el flujo nutritivo basal en ausencia (sonda 1) y presencia (Sondas 3-7) de los inhibidores de la NADPH oxidasa, y para servir como un período de control dentro de la sonda antes de la perfusión de SNP (Sonda 2). Fase 2: las soluciones de perfusión en la segunda sonda se cambiarán para que contengan la solución de control más nitroprusiato de sodio 50 mM (SNP: para controlar los cambios no dependientes del endotelio). Se agregarán 100 µM de Amplex UltraRed y 1 U/mL de peroxidasa de rábano picante (HRP) al perfundido en las otras sondas para medir la producción de H2O2 in vivo. Luego se recolectarán tres muestras de dializado de veinte minutos durante los siguientes 60 minutos para proporcionar estas medidas en ausencia de superóxido dismutasa. Fase 3: luego se agregarán 10 U/mL de superóxido dismutasa (SOD) a los perfundidos que contienen Amplex UltraRed/HRP. Luego se recolectarán tres muestras de dializado de veinte minutos durante los siguientes 60 minutos para proporcionar medidas de los efectos de SNP, apocinina 1 mM, MitoTempo 100 nM, MitoTempo 100 uM + apocinina, GKT 137831 100 nM o GKT 137831 100 nM + apocinina en ausencia de CÉSPED. Fase 4: las soluciones de perfusión en las sondas dos a siete se cambiarán para contener la solución de control más Ach 50 mM (para determinar los cambios dependientes del endotelio), o ACh 50 mM + apocinina 1 mM, MitoTempo 100 nM, MitoTempo+ 100 uM Apocinina, GKT 137831 100 nM o GKT 137831 100 nM + apocinina (para determinar si la inhibición de la NADPH oxidasa o la producción de ROS mitocondrial mejora la respuesta dependiente del endotelio). Luego, las sondas se perfundirán durante 60 minutos para permitir el equilibrio con el entorno local. Luego se recolectarán tres muestras de diez minutos durante los siguientes 30 minutos para determinar los efectos de flujo nutritivo de ACH en presencia y ausencia de NADPH oxidasa o inhibición de ROS mitocondrial. Para cada muestra en la que se agreguen Amplex UltraRed y HRP al medio de perfusión, se medirán inmediatamente 30 µL de dializado para H2O2 en el fluorómetro de laboratorio. Para cada muestra en la que se mida el flujo sanguíneo, el dializado se almacenará a 4 °C y se analizará para detectar etanol (para flujo sanguíneo/intercambio microvascular) dentro de las 24 horas. Todos los perfundidos y dializados estarán protegidos de la exposición a la luz.

Relación de salida/entrada de etanol de microdiálisis Se incluirá etanol (5 mM) en el medio de perfusión para controlar el flujo sanguíneo nutritivo/intercambio microvascular en el área de la sonda de microdiálisis como se describe en nuestras publicaciones anteriores 30-32.

Determinación de la capacidad aeróbica máxima (antes y después del entrenamiento físico):

Todos los sujetos realizarán una prueba de ejercicio máximo estandarizada en una cinta rodante al inscribirse en el estudio y nuevamente al finalizar el programa de entrenamiento. Los sujetos ajustarán individualmente la velocidad y la inclinación (3-6 km·hr-1, 0-5 %) durante un período de calentamiento de 5 minutos. Después del período de calentamiento, el O2 y el CO2 espirados del sujeto se monitorearán continuamente a través de una espirometría de circuito abierto (TrueOne 2400; Parvomedics; Salt Lake City, UT). La prueba de VO2peak se realizará utilizando un protocolo de rampa en el que la velocidad será constante y la inclinación aumentará un 2 % cada dos minutos hasta que se alcance el VO2peak. La velocidad inicial se ajustará individualmente en función de las velocidades de calentamiento y la frecuencia cardíaca, con la intención de obtener el VO2pico en 8-12 minutos.

Protocolo de entrenamiento Todos los participantes realizarán entrenamiento de ejercicios aeróbicos por intervalos tres veces por semana en días no consecutivos durante ocho semanas. El ejercicio consistirá en caminar/correr una pendiente en una caminadora. Los sujetos calentarán durante 10 minutos al 70 % de la frecuencia cardíaca máxima (FCmáx determinada durante la prueba de VO2máx) antes de realizar cuatro intervalos de 4 minutos al 90 % de la FCmáx con una recuperación activa de 3 minutos al 70 % de la FCmáx entre intervalos y un período de enfriamiento de 5 minutos, lo que da un tiempo total de ejercicio de 40 minutos.

Determinación de la composición corporal La masa libre de grasa, la masa grasa y el porcentaje de grasa corporal se determinarán mediante absorciometría de rayos X de energía dual (DXA; GE Lunar Prodigy Advance, Madison WI). Se medirá la masa corporal y la altura para el cálculo del índice de masa corporal (IMC: kg/m2). También se medirán las circunferencias mínima de la cintura y máxima de la cadera para ser utilizadas potencialmente como una covariable en los análisis estadísticos debido a la relación de la relación peso/peso y la circunferencia de la cintura con el riesgo de enfermedad cardiometabólica.

Marcadores musculares de estrés oxidativo:

Por lo tanto, se tomarán biopsias en estado de reposo antes y después del entrenamiento en aquellos participantes que estén de acuerdo con el procedimiento de biopsia. Se obtendrán biopsias musculares percutáneas del vasto lateral del grupo muscular cuádriceps femoral (que se somete a adaptaciones al entrenamiento físico propuesto) utilizando procedimientos estériles y después de la administración de anestesia local (lidocaína al 1%).