Role TBC1D4 ve cvičením a inzulínem indukovaném metabolismu glukózy v lidském kosterním svalu

Nedávno byla objevena běžná grónská nesmyslná varianta p.Arg684erTer (ve které je arginin nahrazen terminačním kodonem) v genu TBC1D4. Varianta má frekvenci alel 17 %. Homozygotní nosiči této varianty TBC1D4 mají zhoršenou glukózovou toleranci a 10krát zvýšené riziko T2D. Výzkumníci navrhují provést komplexní metabolickou fenotypizaci dospělých Inuitů nesoucích nula nebo dvě alely varianty TBC1D4. Výzkumníci předpokládají, že regulace TBC1D4 v kosterním svalu je klíčová při regulaci vychytávání glukózy během cvičení, během fyziologické stimulace inzulínem a pro schopnost akutního záchvatu cvičení zlepšit citlivost na inzulín k regulaci metabolismu glukózy u lidí.

Naše celkové cíle v tomto projektu jsou:

1. Zjistěte, zda varianta TBC1D4 p.Arg684Ter ovlivňuje regulaci vychytávání glukózy v kosterním svalstvu během cvičení a během fyziologické stimulace inzulínem.
2. Určete účinek varianty TBC1D4 p.Arg684Ter na schopnost akutního cvičení senzibilizovat kosterní svalstvo inzulínem k regulaci metabolismu glukózy.
3. Definujte metabolické dráhy ovlivněné variantou p.Arg684Ter za účelem identifikace kauzálních faktorů odpovědných za diabetický fenotyp inuitských přenašečů.

Získané poznatky přispějí k dalším vysvětlujícím vodítkům ke zvýšené frekvenci T2D v nosičích.

Studijní populace:

Studie Inuit Health in Transition (IHIT) je studie dospělých v západním a východním Grónsku. Účastníci byli vybráni prostřednictvím stratifikovaného náhodného vzorku a data byla sbírána v letech 1999-2010 pomocí klinických postupů, odběru biologického materiálu a dotazníků. Aby bylo dosaženo cíle, výzkumníci provedou komplexní metabolickou fenotypizaci Inuitů nesoucích nula (n=10) nebo dvě (n=10) alely varianty TBC1D4 p.Arg684Ter rekrutované z této kohorty. Na základě účinku 1,2 SD, jak bylo zjištěno pro hladiny glukózy v plazmě během orálního testu glukózové tolerance (OGTT) v předchozí studii (6) mezi homozygotními přenašeči a nenositeli varianty TBCD14, výzkumníci dosáhli 89% síly při p= 0,05 při náboru 10 homozygotních přenašečů a 10 nepřenašečů.

Metody:

Genotypizace kohorty IHIT již byla provedena. Vyšetřovatelé tak mohou znovu zavolat účastníky studie pro tuto studii na základě jejich známého genotypu. Výzkumníci mají v úmyslu provést vysoce invazivní fyziologické studie subjektů s bodovou mutací TBC1D4 a kontrolních subjektů odpovídajících věku, pohlaví a BMI. Účastníky budou muži bez diabetu (25–50 let), kteří byli vybráni prostřednictvím kohortového registru IHIT (n=4 200). Nábor, screening a počáteční klinická vyšetření (orální glukózový toleranční test a testy fyzické zátěže, včetně přizpůsobení na jednonohý cyklistický ergometr) budou probíhat v Grónsku. Nejinvazivnější část studie, popsaná níže, bude probíhat v dánské Kodani.

Během pobytu v Kodani účastníci dostanou energeticky přizpůsobenou, standardizovanou stravu, kterou budou konzumovat 3 dny před intervenční studií. V den studie dorazí účastníci do laboratoře po nočním půstu. Katetry budou umístěny do obou femorálních žil (V) a do jedné femorální tepny (A). Svalová biopsie bude získána z vastus lateralis jedné nohy (klidová noha). Účastníci poté budou jednu hodinu provádět cvičení extenzoru kolena na jedné noze, přičemž druhou nohu nechají jako odpočinutou kontrolní nohu. Bezprostředně po cvičení bude odebrána biopsie z cvičící nohy a účastníci budou odpočívat nalačno po dobu 3 hodin, než se odebere třetí sada svalových biopsií (z obou nohou) a jedna biopsie břišního podkožního tuku. Následně bude vyhodnocena inzulinová senzitivita během 2hodinového fyziologického hyperinzulinemického euglykemického clampu. Na konci svorky bude získána poslední sada biopsií (obě nohy) a jedna biopsie abdominálního podkožního tuku. V průběhu celého studijního dne odběr vzorků tepny a žilní krve/plazmy umožňuje odhadnout extrakci substrátu dvěma nohami. Kromě toho měření průtoku krve tepnou pomocí ultrazvukové dopplerovské techniky umožní konečný výpočet příjmu/uvolňování substrátu přes dvě nohy před cvičením, během cvičení a při zotavování po cvičení. Důležité je, že schopnost inzulinu stimulovat tento proces může být hodnocena jak v klidové, tak v dříve cvičené noze.

Výzkumníci plánují provést hluboké profilování transkriptů vzorků svalové tkáně a definovat korelace mezi věkem, pohlavím, BMI, genetickými variantami a transkripčními profily, aby pochopili dopad identifikovaných metabolických genetických variant na genovou regulaci. Aby bylo možné definovat klíčové biochemické dráhy ovlivněné mutovaným TBC1D4, výzkumníci provedou metabolomické analýzy vzorků svalové biopsie. Aby bylo možné identifikovat domnělé cílené dráhy ovlivněné mutací, provedou výzkumníci interaktom na bázi hmotnostní spektrometrie a také proteomické / fosfoproteomické analýzy. Na základě těchto dat a dat získaných z metabolických analýz budou výzkumníci schopni lépe identifikovat postižené metabolické procesy podílející se na progresi k diabetickému fenotypu inuitských nosičů. Takové dráhy budou v následných analýzách podrobněji biochemicky studovány včetně dalších (k fosforylaci) posttranslačních modifikací (např. glykosylace), stejně jako exprese/aktivity klíčových enzymů v metabolismu glukózy a tuků.