Rola TBC1D4 w metabolizmie glukozy wywołanym wysiłkiem fizycznym i insuliną w ludzkich mięśniach szkieletowych

Niedawno odkryto powszechny grenlandzki nonsensowny wariant p.Arg684erTer (w którym arginina jest zastąpiona kodonem terminacyjnym) w genie TBC1D4. Wariant ma częstość alleli 17%. Homozygotyczni nosiciele tego wariantu TBC1D4 mają upośledzoną tolerancję glukozy i 10-krotnie zwiększone ryzyko T2D. Badacze proponują przeprowadzenie kompleksowego fenotypowania metabolicznego dorosłych Eskimosów posiadających zero lub dwa allele wariantu TBC1D4. Badacze postawili hipotezę, że regulacja TBC1D4 w mięśniach szkieletowych ma kluczowe znaczenie w regulacji wychwytu glukozy podczas ćwiczeń, podczas fizjologicznej stymulacji insuliną oraz zdolności ostrego wysiłku fizycznego do poprawy wrażliwości na insulinę w celu regulacji metabolizmu glukozy u ludzi.

Nasze ogólne cele w obecnym projekcie to:

1. Określenie, czy wariant TBC1D4 p.Arg684Ter wpływa na regulację wychwytu glukozy w mięśniach szkieletowych podczas wysiłku fizycznego oraz podczas fizjologicznej stymulacji insuliną.
2. Określić wpływ wariantu TBC1D4 p.Arg684Ter na zdolność intensywnego wysiłku fizycznego do uwrażliwienia mięśni szkieletowych na insulinę w celu regulacji metabolizmu glukozy.
3. Zdefiniuj szlaki metaboliczne, na które wpływa wariant p.Arg684Ter, aby zidentyfikować czynniki przyczynowe odpowiedzialne za fenotyp cukrzycowy nosicieli Eskimosów.

Uzyskana wiedza przyczyni się do dodatkowych wskazówek wyjaśniających zwiększoną częstość T2D u nosicieli.

Badana populacja:

Badanie Inuit Health in Transition (IHIT) obejmuje osoby dorosłe z Zachodniej i Wschodniej Grenlandii. Uczestnicy zostali wybrani z warstwowej próby losowej, a dane zebrano w latach 1999-2010 za pomocą procedur klinicznych, pobierania materiału biologicznego i kwestionariuszy. Aby osiągnąć ten cel, badacze przeprowadzą kompleksowe fenotypowanie metaboliczne Eskimosów posiadających zero (n=10) lub dwa (n=10) allele wariantu TBC1D4 p.Arg684Ter rekrutowanych z tej kohorty. W oparciu o efekt 1,2 SD stwierdzony dla poziomów glukozy w osoczu podczas doustnego testu tolerancji glukozy (OGTT) w poprzednim badaniu (6) między homozygotycznymi nosicielami i niebędącymi nosicielami wariantu TBCD14, badacze osiągają 89% mocy przy p= 0,05 przy rekrutacji 10 homozygotycznych nosicieli i 10 niebędących nosicielami.

Metody:

Genotypowanie kohorty IHIT zostało już przeprowadzone. W ten sposób badacze mogą ponownie wezwać uczestników badania do niniejszego badania na podstawie ich znanego genotypu. Badacze zamierzają przeprowadzić wysoce inwazyjne badania fizjologiczne osób z mutacją punktową TBC1D4 oraz osób kontrolnych dobranych pod względem wieku, płci i BMI. Uczestnikami będą mężczyźni bez cukrzycy (25-50 lat) rekrutowani z rejestru kohortowego IHIT (n=4200). Rekrutacja, selekcja i wstępne badania kliniczne (doustny test obciążenia glukozą i testy wysiłkowe, w tym dostosowanie do jednonożnego ergometru rowerowego) odbędą się na Grenlandii. Najbardziej inwazyjna część badania, opisana poniżej, odbędzie się w Kopenhadze w Danii.

Podczas pobytu w Kopenhadze uczestnicy otrzymają zbilansowaną, ustandaryzowaną dietę do spożycia na 3 dni przed badaniem interwencyjnym. W dniu badania uczestnicy przybędą do laboratorium po całonocnym poście. Cewniki zostaną umieszczone w obu żyłach udowych (V) iw jednej tętnicy udowej (A). Biopsja mięśnia zostanie pobrana z mięśnia obszernego bocznego jednej nogi (nogi spoczynkowej). Następnie uczestnicy będą wykonywać ćwiczenie prostownika kolana jednej nogi przez godzinę, pozostawiając drugą nogę jako wypoczętą nogę kontrolną. Bezpośrednio po ćwiczeniach zostanie pobrana biopsja ćwiczącej nogi, a uczestnicy będą odpoczywać na czczo przez 3 godziny, zanim zostanie pobrana trzecia seria biopsji mięśni (z obu nóg) i jedna biopsja podskórnej tkanki tłuszczowej brzucha. Następnie wrażliwość na insulinę zostanie oceniona podczas 2-godzinnej fizjologicznej klamry euglikemicznej z hiperinsulinemią. Pod koniec zacisku uzyskany zostanie końcowy zestaw biopsji (obie nogi) i jedna biopsja podskórnej tkanki tłuszczowej brzucha. Pobieranie próbek krwi tętniczej i żylnej/osocza przez cały dzień badania umożliwia oszacowanie ekstrakcji substratu przez obie nogi. Ponadto, pomiary przepływu krwi w tętnicach techniką ultradźwiękowego dopplera pozwolą na ostateczne obliczenie wychwytu/uwalniania substratu przez obie nogi przed wysiłkiem, podczas wysiłku iw okresie rekonwalescencji po wysiłku. Co ważne, zdolność insuliny do stymulacji tego procesu można ocenić zarówno w wypoczętej, jak i wcześniej ćwiczonej nodze.

Badacze planują przeprowadzić głębokie profilowanie transkryptów próbek tkanki mięśniowej i zdefiniować korelacje między wiekiem, płcią, BMI, wariantami genetycznymi i profilami transkrypcyjnymi, aby zrozumieć wpływ zidentyfikowanych metabolicznych wariantów genetycznych na regulację genów. W celu zdefiniowania kluczowych szlaków biochemicznych, na które wpływa zmutowany TBC1D4, badacze przeprowadzą analizy metabolomiczne próbek pobranych z biopsji mięśni. W celu zidentyfikowania przypuszczalnych szlaków docelowych, na które wpływa mutacja, badacze przeprowadzą interaktom oparty na spektrometrii mas, a także analizy proteomiczne/fosfoproteomiczne. Na podstawie tych danych oraz danych uzyskanych z analiz metabolicznych badacze będą w stanie lepiej zidentyfikować dotknięte procesy metaboliczne związane z postępem w kierunku fenotypu cukrzycowego nosicieli Eskimosów. Takie szlaki będą w kolejnych analizach bardziej szczegółowo badane biochemicznie, w tym dodatkowe (do fosforylacji) modyfikacje potranslacyjne (np. glikozylacja) oraz ekspresja/aktywność kluczowych enzymów w metabolizmie glukozy i tłuszczów.