Роль TBC1D4 в индуцированном физической нагрузкой и инсулином метаболизме глюкозы в скелетных мышцах человека

Недавно был обнаружен обычный гренландский нонсенс вариант p.Arg684erTer (в котором аргинин заменен терминирующим кодоном) в гене TBC1D4. Вариант имеет частоту аллеля 17%. Гомозиготные носители этого варианта TBC1D4 имеют нарушенную толерантность к глюкозе и в 10 раз повышенный риск развития СД2. Исследователи предлагают провести комплексное метаболическое фенотипирование взрослых инуитов, несущих ноль или два аллеля варианта TBC1D4. Исследователи предполагают, что регуляция TBC1D4 в скелетных мышцах играет ключевую роль в регуляции поглощения глюкозы во время упражнений, во время физиологической стимуляции инсулином, а также в способности резкого приступа упражнений улучшать чувствительность к инсулину для регулирования метаболизма глюкозы у людей.

Нашими общими целями в настоящем проекте являются:

1. Определите, влияет ли вариант TBC1D4 p.Arg684Ter на регуляцию поглощения глюкозы скелетными мышцами во время физических упражнений и во время физиологической стимуляции инсулином.
2. Определите влияние варианта TBC1D4 p.Arg684Ter на способность резкой физической нагрузки повышать чувствительность скелетных мышц к инсулину для регулирования метаболизма глюкозы.
3. Определите метаболические пути, на которые влияет вариант p.Arg684Ter, чтобы определить причинные факторы, ответственные за диабетический фенотип носителей инуитов.

Полученные знания будут способствовать получению дополнительных пояснений к повышенной частоте СД2 у носителей.

Исследуемая популяция:

Исследование «Здоровье инуитов в переходный период» (IHIT) — это исследование взрослых жителей Западной и Восточной Гренландии. Участники были отобраны путем стратифицированной случайной выборки, а данные были собраны в 1999-2010 годах с использованием клинических процедур, отбора биологического материала и анкетирования. Для достижения цели исследователи проведут комплексное метаболическое фенотипирование инуитов, несущих ноль (n=10) или два (n=10) аллеля варианта TBC1D4 p.Arg684Ter, рекрутированных из этой когорты. Основываясь на эффекте 1,2 SD, обнаруженном для уровней глюкозы в плазме во время перорального теста на толерантность к глюкозе (OGTT) в предыдущем исследовании (6) между гомозиготными носителями и не носителями варианта TBCD14, исследователи достигают мощности 89% при p = 0,05 при наборе 10 гомозиготных носителей и 10 не носителей.

Методы:

Генотипирование когорты IHIT уже выполнено. Таким образом, исследователи могут повторно вызвать участников исследования для настоящего исследования на основе их известного генотипа. Исследователи намерены провести высокоинвазивные физиологические исследования субъектов с точечной мутацией TBC1D4 и контрольных субъектов, соответствующих возрасту, полу и ИМТ. Участниками будут мужчины без диабета (25-50 лет), набранные через когортный регистр IHIT (n = 4200). Набор, скрининг и первоначальные клинические исследования (пероральный тест на толерантность к глюкозе и тесты на физическую нагрузку, включая настройку одноногого велоэргометра) будут проходить в Гренландии. Самая инвазивная часть исследования, описанная ниже, будет проходить в Копенгагене, Дания.

Во время пребывания в Копенгагене участники получат стандартизированную диету, соответствующую калорийности, которую они должны употреблять за 3 дня до интервенционного исследования. В день исследования участники прибудут в лабораторию после ночного голодания. Катетеры будут помещены в обе бедренные вены (V) и в одну бедренную артерию (A). Мышечная биопсия будет получена из латеральной широкой мышцы одной ноги (нога покоя). Затем участники будут выполнять упражнение на разгибание колена на одной ноге в течение одного часа, оставляя другую ногу в качестве контрольной. Сразу после тренировки будет взята биопсия тренируемой ноги, и участники будут отдыхать натощак в течение 3 часов, прежде чем будет взята третья серия биопсий мышц (с обеих ног) и одна биопсия брюшной подкожной жировой клетчатки. Впоследствии чувствительность к инсулину будет оцениваться во время 2-часового физиологического гиперинсулинемического эугликемического клэмпа. К концу зажима будет получен окончательный набор биоптатов (обе ноги) и одна биопсия абдоминальной подкожной жировой клетчатки. В течение дня исследования образцы артериальной и венозной крови/плазмы позволяют оценить экстракцию субстрата двумя ногами. Кроме того, измерение артериального кровотока методом ультразвуковой допплерографии позволит окончательно рассчитать поглощение/высвобождение субстрата в обеих ногах перед тренировкой, во время тренировки и при восстановлении после тренировки. Важно отметить, что способность инсулина стимулировать этот процесс может быть оценена как в отдохнувшей, так и в ранее тренированной ноге.

Исследователи планируют провести глубокое профилирование транскриптов образцов мышечной ткани и определить корреляции между возрастом, полом, ИМТ, генетическими вариантами и профилями транскрипции, чтобы понять влияние выявленных метаболических генетических вариантов на регуляцию генов. Чтобы определить ключевые биохимические пути, на которые влияет мутировавший TBC1D4, исследователи проведут метаболомический анализ образцов биопсии мышц. Чтобы идентифицировать предполагаемые целевые пути, затронутые мутацией, исследователи проведут интерактом на основе масс-спектрометрии, а также протеомный/фосфопротеомный анализ. На основе этих данных и данных, полученных в результате метаболического анализа, исследователи смогут лучше идентифицировать затронутые метаболические процессы, связанные с прогрессированием диабетического фенотипа у инуитских носителей. Такие пути в последующем анализе будут изучены биохимически более подробно, включая дополнительные (помимо фосфорилирования) посттрансляционные модификации (например, гликозилирование), а также экспрессию/активность ключевых ферментов метаболизма глюкозы и жиров.