De rol van TBC1D4 bij door inspanning en insuline geïnduceerd glucosemetabolisme in menselijke skeletspieren

Onlangs werd een veel voorkomende Groenlandse onzin p.Arg684erTer-variant (waarin arginine is vervangen door een terminatiecodon) in het gen TBC1D4 ontdekt. De variant heeft een allelfrequentie van 17%. Homozygote dragers van deze TBC1D4-variant hebben een verminderde glucosetolerantie en een 10-voudig verhoogd risico op T2D. De onderzoekers stellen voor om uitgebreide metabolische fenotypering uit te voeren van volwassen Inuits die nul of twee allelen van de TBC1D4-variant dragen. De onderzoekers veronderstellen dat regulatie van TBC1D4 in skeletspieren cruciaal is bij het reguleren van de glucoseopname tijdens inspanning, tijdens fysiologische insulinestimulatie en voor het vermogen van een acute periode van inspanning om de insulinegevoeligheid te verbeteren om het glucosemetabolisme bij mensen te reguleren.

Onze algemene doelstellingen in het huidige project zijn:

1. Bepaal of de TBC1D4 p.Arg684Ter-variant invloed heeft op de regulatie van glucoseopname in skeletspieren tijdens inspanning en tijdens fysiologische insulinestimulatie.
2. Bepaal het effect van de TBC1D4 p.Arg684Ter-variant op het vermogen van acute inspanning om de skeletspieren gevoelig te maken voor insuline om het glucosemetabolisme te reguleren.
3. Definieer de metabole routes die worden beïnvloed door de p.Arg684Ter-variant om oorzakelijke factoren te identificeren die verantwoordelijk zijn voor het diabetische fenotype van Inuit-dragers.

De gegenereerde kennis zal bijdragen aan aanvullende verklarende aanwijzingen voor de verhoogde frequentie van T2D in de dragers.

Studiepopulatie:

Het Inuit Health in Transition (IHIT)-onderzoek is een onderzoek onder volwassenen in West- en Oost-Groenland. De deelnemers werden geselecteerd via een gestratificeerde willekeurige steekproef en gegevens werden verzameld in 1999-2010 met behulp van klinische procedures, bemonstering van biologisch materiaal en vragenlijsten. Om het doel te bereiken, zullen de onderzoekers uitgebreide metabole fenotypering uitvoeren van Inuits die nul (n=10) of twee (n=10) allelen dragen van de TBC1D4 p.Arg684Ter-variant die uit dit cohort is gerekruteerd. Gebaseerd op een effect van 1,2 SD zoals gevonden voor plasmaglucosewaarden tijdens een orale glucosetolerantietest (OGTT) in de vorige studie (6) tussen homozygote dragers en niet-dragers van de TBCD14-variant, behalen de onderzoekers 89% power bij p= 0,05 bij het werven van 10 homozygote dragers en 10 niet-dragers.

methoden:

Genotypering van het IHIT-cohort is al uitgevoerd. Zodoende kunnen de onderzoekers studiedeelnemers opnieuw oproepen voor de huidige studie op basis van hun bekende genotype. De onderzoekers zijn van plan zeer invasieve fysiologische studies uit te voeren bij proefpersonen die de TBC1D4-puntmutatie herbergen en bij controlepersonen die qua leeftijd, geslacht en BMI overeenkomen. De deelnemers zullen niet-diabetische (25-50 jaar) mannen zijn die zijn gerekruteerd via het IHIT-cohortregister (n=4.200). De werving, screening en initiële klinische onderzoeken (orale glucosetolerantietest en lichamelijke inspanningstests, inclusief aanpassing aan een eenbenige fietsergometer) vinden plaats in Groenland. Het meest ingrijpende deel van het onderzoek, dat hieronder wordt beschreven, zal plaatsvinden in Kopenhagen, Denemarken.

Tijdens het verblijf in Kopenhagen krijgen de deelnemers een op energie afgestemd, gestandaardiseerd dieet dat 3 dagen voorafgaand aan de interventiestudie moet worden geconsumeerd. Op de studiedag komen de deelnemers na een nacht vasten aan in het laboratorium. Katheters worden in beide dijbeenaders (V) en in één dijbeenslagader (A) geplaatst. Er wordt een spierbiopsie genomen van vastus lateralis van één been (rustbeen). De deelnemers voeren vervolgens een uur lang een knie-extensoroefening met één been uit en laten het andere been als een rustend controlebeen. Onmiddellijk na het sporten wordt er een biopsie genomen van het te oefenen been en rusten de deelnemers 3 uur in nuchtere toestand voordat een derde set spierbiopten (van beide benen) en één abdominaal onderhuids vetbiopsie worden genomen. Vervolgens wordt de insulinegevoeligheid geëvalueerd tijdens een 2 uur durende fysiologische hyperinsulinemische euglycemische klem. Aan het einde van de klem wordt een laatste set biopsieën (beide benen) en een biopsie van onderhuids vet in de buik verkregen. Gedurende de hele studiedag maken bemonstering van arteriële en veneuze bloed-/plasmamonsters een schatting van de substraatextractie door de twee benen. Verder zullen metingen van de arteriële bloedstroom door middel van ultrasone Doppler-techniek een definitieve berekening mogelijk maken van de opname/afgifte van substraat over de twee benen vóór inspanning, tijdens inspanning en bij herstel van inspanning. Belangrijk is dat het vermogen van insuline om dit proces te stimuleren kan worden beoordeeld in zowel een rustend als in het eerder geoefende been.

De onderzoekers zijn van plan om diepe transcriptieprofilering van spierweefselmonsters uit te voeren en correlaties tussen leeftijd, geslacht, BMI, genetische varianten en de transcriptieprofielen te definiëren om de impact op genregulatie van geïdentificeerde metabole genetische varianten te begrijpen. Om de belangrijkste biochemische routes te definiëren die worden beïnvloed door het gemuteerde TBC1D4, zullen de onderzoekers metabolomische analyses uitvoeren van de spierbiopsiemonsters. Om vermoedelijke gerichte routes te identificeren die door de mutatie zijn beïnvloed, zullen de onderzoekers op massaspectrometrie gebaseerde interactoom- en proteomische / fosfoproteomische analyses uitvoeren. Op basis van deze gegevens en gegevens verkregen uit de metabole analyses, zullen de onderzoekers beter in staat zijn om de aangetaste metabole processen te identificeren die betrokken zijn bij de progressie naar het diabetische fenotype van de Inuit-dragers. Dergelijke routes zullen in latere analyses biochemisch in meer detail worden bestudeerd, inclusief aanvullende (na fosforylering) post-translatiemodificaties (bijv. glycosylering) evenals expressie/activiteiten van sleutelenzymen in glucose- en vetmetabolisme.