Komorbidity a koinfekce u latentní TBC (COMBINE-TB)

Design studie: Toto je průřezová studie k identifikaci jedinců s LTBI a koinfekcemi/komorbiditami: podvýživa; DM; a helmintové infekce. Jedinci budou nejprve klinicky vyšetřeni na příznaky aktivní TBC. Jedinci se symptomy aktivní TBC budou ze studie vyloučeni a odesláni k léčbě. Jedinci, kteří jsou asymptomatičtí na aktivní TBC, budou vyšetřeni na LTBI testem uvolňování interferonu gama (IFNγ) (IGRA) a klinicky vyšetřeni na podvýživu (podle indexu tělesné hmotnosti [BMI]), vyhodnotí se stav DM (podle hladin hemoglobinu A1c [HbA1c] ) a hodnocena na hlístovou infekci (sérologicky a kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí stolice [qPCR]).

Jedinci, kteří jsou způsobilí, budou zařazeni do jedné ze šesti studijních skupin na základě stavu LTBI a přítomnosti koinfekcí/komorbidit. Účastníci absolvují další studijní návštěvu do 6 měsíců od screeningu pro klinické hodnocení a poskytnou vzorky krve (30 ml), moči a stolice pro experimentální studie a uskladnění pro budoucí výzkum. Klíčová výzkumná hodnocení budou zahrnovat analýzy genové exprese a imunofenotypizaci vzorků krve.

Velikost vzorku:

Primární cíl: N=5000

Sekundární cíl: N=300; n=50 pro každou z následujících skupin:

1. latentní tuberkulózní (TB) infekce (LTBI) a podvyživený;
2. LTBI s nekontrolovaným diabetes mellitus (DM);
3. LTBI s helmintovou infekcí;
4. LTBI s více komorbiditami;
5. LTBI bez komorbidit (LTBI+ zdravé kontroly); a
6. LTBI negativní zdravé kontroly

Studijní populace: Dospělí a dospívající (14-65 let) s nebo bez LTBI.

Primární cíl: Odhadnout prevalenci malnutrice, DM a helmintových infekcí u jedinců s LTBI.

Sekundární cíl: Stanovit účinek koinfekcí/komorbidit na biologické signatury LTBI pomocí sekvenování RNA (RNA-seq), proteomiky, metabolomiky a imunologických testů.

Cílové body: Prevalence malnutrice, DM a hlístových infekcí u jedinců s LTBI a jejich vliv na biologické signatury.

Zápis bude pokračovat, dokud nebude plně zaregistrován jak celkový screeningový vzorek, tak 6 studijních skupin. Velikost screeningového vzorku zvýšíme na 6000, pokud požadované velikosti vzorku studijní skupiny nebude dosaženo screeningem 5000 účastníků.

Plán náboru: Screeningová fáze této studie bude komunitní studie v jižní Indii. Účastníci se budou rekrutovat z vesnic v okrese Kancheepuram, kde přibližně 50 % dospělé populace testuje pozitivně na LTBI pomocí IGRA na základě naší předchozí studie (nepublikovaná data). Na základě naší předchozí studie také předpokládáme, že procento dospělé populace pozitivní na podvýživu je 35 %, na DM 20 % a na helmintovou infekci 20 % (nepublikovaná data).

Sčítání lidu ve vesnicích v okrese Kancheepuram je každoročně aktualizováno místními zdravotníky zaměstnanými ministerstvem veřejného zdraví a terénními týmy NIRT v Chennai v Indii. Vesnice budou vybrány po konzultaci s ministerstvem veřejného zdraví v Tamil Nadu. Terénní týmy NIRT budou distribuovat brožury o studii, aby rozšířily povědomí. Brožura bude před použitím schválena Institucionálním etickým výborem (IEC).

Klinická hodnocení:

Fyzikální vyšetření a anamnéza: Ve fázi screeningu bude provedena kontrola anamnézy a pravidelné fyzikální vyšetření (včetně výšky, hmotnosti, vitálních funkcí).

Během fáze studie bude odebrána kompletní anamnéza, stejně jako pravidelné fyzické vyšetření s vitálními funkcemi a antropometrickými měřeními, včetně výšky, hmotnosti, skóre BMI Z, skóre hmotnosti pro výšku Z, obvodu střední části paže, pasu a břicha. obvod, poměr obvodu pasu a boků, tloušťka kožní řasy a síla úchopu a analýza bioelektrické impedance. Pro analýzu bioelektrické impedance bude použit multifrekvenční analyzátor složení těla (Bodystat Quadscan 4000) k odvození údajů o složení těla. Měření budou prováděna s lehkým oblečením a podle standardních doporučení pro provádění měření bioelektrické impedance (např. konzistentní denní doba, vylučování moči před měřením, vyhýbání se měření krátce po hlavním jídle nebo cvičení). Údaje o složení těla odvozené ze zdrojových údajů budou hmotnost tělesného tuku, hmotnost bez tuku a hmotnost tělesných buněk. Index viscerální adipozity bude vypočítán na základě pohlaví, BMI, triglyceridů a cholesterolu s vysokou hustotou lipoproteinů (HDL). Kromě toho budou také zadávány dotazníky pro kouření a užívání drog a alkoholu, včetně odhadu skóre testu identifikace poruchy užívání alkoholu (AUDIT).

Odběr krve: Ve fázi screeningu bude každému účastníkovi nejprve odebráno venepunkcí celkem 10 ml krve. Fáze studie bude zahrnovat dodatečný odběr 30 ml krve. Krev bude použita pro laboratorní vyšetření.

Odběr moči: Vzorky moči budou odebrány, uloženy a vyhodnoceny.

Odběr stolice: Vzorky stolice budou odebírány do specializovaných nádob a budou použity pro extrakci a skladování DNA.

Sběr stolice/moči doma: Účastníci, kteří nemohou poskytnout moč a/nebo stolici při studijní návštěvě, ji mohou poskytnout do 3 dnů. Studijní tým poskytne pokyny pro odběr a skladování vzorků.

Laboratorní hodnocení:

Krev odebraná ve fázi screeningu bude použita pro následující hodnocení.

1. Hematologie: Kompletní krevní obraz s diferenciálem a hladinami hematokritu. 2. IGRA (QuantiFERON-TB Plus Gold In-Tube; Qiagen) pro potvrzení stavu LTBI. 3. Biochemie: HbA1c, náhodná glykémie, aspartátaminotransferáza (AST), alaninaminotransferáza (ALT), močovina a kreatinin.

4. ELISA k identifikaci a kvantifikaci infekce Wuchereria bancrofti. 5. Skladování pro budoucí výzkum. Krev odebraná ve fázi studie bude použita pro následující hodnocení.

1. Glukóza nalačno, HbA1c a další biochemické parametry.
2. Hladiny makro- a mikroživin, včetně sérového albuminu, C-reaktivního proteinu, cholesterolu (celkový, HDL, lipoprotein s nízkou hustotou, triglyceridy), vitamínů A, B6, B12, C, D a E, selenu a zinku.
3. U LTBI-negativních jedinců opakujte IGRA pro potvrzení stavu LTBI. Pokud je test pozitivní, zbývající krev bude vyřazena a jedinec bude vyřazen z LTBI negativní kohorty.
4. Odběr krve ze zkumavky Tempus nebo PAXgene pro izolaci DNA a RNA pro experimentální studie a skladování pro budoucí výzkum. Podle tohoto protokolu nebudou prováděny žádné genetické testy na lidech.
5. Izolace mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) pro experimentální studie a skladování pro budoucí výzkum.
6. Sérum bude také shromážděno pro experimentální studie a skladování pro budoucí výzkum.

Vzorky stolice budou použity pro následující hodnocení.

1. Při screeningu DNA stolice pro diagnostiku qPCR k detekci měchovců, Ascaris, Strongyloides a Trichuris.
2. Skladování pro budoucí výzkum.

Kromě toho budou vzorky moči odebrané ve fázi studie použity pro následující hodnocení.

1. Proteomické a metabolomické výzkumy.
2. Skladování pro budoucí výzkum.

Výsledky klinických hodnocení budou vráceny účastníkům.

Experimentální studie:

Transkriptomika: Provedeme analýzu RNA seq na 50 jedincích v každé skupině, abychom prozkoumali transkriptomický podpis. RNA bude extrahována ze zkumavek Tempus nebo PAXgene, kódována a analyzována pomocí RNA seq. Získaná data pak budou vyhodnocena na vzorce a změny RNA exprese.

Proteomika: Proteomika krve a moči se rychle stává hlavním nástrojem pro pokrok v objevování, ověřování, diagnostice a dalších oblastech biomarkerů. K provedení proteomiky kapalinovou chromatografií s tandemovou hmotnostní spektrometrií použijeme proteomiku séra a moči od podskupiny jedinců (n=30) v každé skupině. Bioinformatická analýza proteinové exprese v těchto skupinách by poskytla užitečné informace o proteinových signaturách LTBI u vysoce rizikových populací.

Metabolomika: K analýze sérových metabolických profilů podskupiny jedinců (n=30) v každé skupině použijeme necílenou kapilární elektroforézu času letu hmotnostní spektrometrie. Metabolomika doplní data získaná z proteomiky.

Imunologické testy:

1. Definujte frekvence populace cirkulujících imunitních buněk průtokovou cytometrií Naše standardizované panely průtokové cytometrie, popsané níže, budou aplikovány na podskupinu jedinců (n=30) v každé skupině (tabulka 1). Budeme měřit frekvence všech hlavních podskupin imunitních buněk: monocytů, NK buněk, B buněk a T buněk, včetně CD56+ T buněk. T buňky budou dále rozděleny na konvenční T buňky (CD4- a CD8 exprimující buňky) a nekonvenční T buňky (invariantní T buňky spojené se sliznicí, NK T buňky a gama delta T buňky). U konvenčních T buněk zachytíme také paměťový fenotyp a u CD4+ T buněk podskupiny Th. Provedeme kontrolu kvality pomocí opakovaných běhů vzorků z kontrolního odběru, abychom ověřili integritu vzorku a kontrolu někdy drastické technické variability pozorované při cytometrických experimentech. Abychom minimalizovali technickou variabilitu, použijeme metodu centralizovaného hradlování, kde budou všechny výsledky analyzovány stejným jednotlivcem.
2. Definujte imunitní signatury PBMC a paměťových CD4+ a CD8+ T buněk Buňky budou tříděny na fluorescenčně aktivovaném buněčném třídění (FACS) Aria cytometru od podskupiny jedinců (n=20) v každé skupině. Minimálně 50 000 buněk každé z PBMC a paměťových CD4+ a CD8+ T buněk bude tříděno do TRIzol LS. Na základě našich zkušeností je nejméně 7 % PBMC paměťových CD4+ T buněk a 4 % paměťových CD8+ T buněk. Profily genové exprese celých PBMC a tříděných paměťových T buněk budou získány pomocí RNA-seq pomocí expresní platformy pro široký genom od Illumina, poskytující úrovně exprese pro >50 000 identifikovaných genů v lidském genomu (včetně neproteinových kódujících druhů RNA). Generování vzorků, příprava knihoven, sekvenování a mapování budou prováděny podle dobře definovaných a standardizovaných protokolů, přičemž v každém hlavním kroku budou zahrnuty kontroly kvality, aby bylo zajištěno vytváření vysoce kvalitních dat. Pro analýzu genové exprese, kde je současně testováno velké množství proměnných, použijeme DESeq Benjamini Hochberg opravené hodnoty p-upravené <0,05 k identifikaci odlišně exprimovaných genů mezi skupinami. Provedeme analýzu dráhy genů významně upregulovaných mezi různými srovnáními a prozkoumáme související genové moduly. K tomuto účelu použijeme webový nástroj Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), abychom určili, které dráhy jsou významně zastoupeny. Plánujeme použít software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) k podrobnějšímu určení směrovosti nadměrně zastoupených funkcí a společných upstream regulátorů pro danou sadu genů. Komplementární přístup bude následovat modulární analýzu, která identifikuje shluky genů, které sdílejí podobný profil exprese. Konkrétně plánujeme použít algoritmus analýzy vážené genové koexpresní sítě (WGCNA). Současným sledováním složení imunitních buněk PBMC, stanovením celkové exprese genu PBMC a určením profilu paměťových CD4+ a CD8+ T buněk můžeme obecně detekovat signatury specifické pro onemocnění v PBMC a identifikovat příspěvek podskupin T buněk k těmto dysregulacím v konkrétní.
3. Definujte antigen-reaktivní buněčné imunitní odpovědi průtokovou cytometrií Antigenově reaktivní buněčné imunitní odpovědi budou měřeny u podskupiny jedinců (n=20) v každé skupině. PBMC budou stimulovány PPD a celobuněčným lyzátem M. tuberculosis po dobu 24 hodin a budou studovány antigenem stimulované buněčné imunitní reakce. Plánujeme prozkoumat panel aktivačních markerů (HLA-DR, CD38, OX-40 a CD153), cytokinů (IL-2, IFNγ, TNFα, IL-17) a cytotoxických markerů (perforin, granzym B, granulysin, CD107a ) na všech hlavních konvenčních a nekonvenčních podskupinách T buněk a NK buňkách.

Návrat výsledků výzkumu Neočekává se, že by experimentální studie odhalily jednotlivé klinické výsledky nebo lékařsky použitelné náhodné nálezy. Proto nebudou účastníkům vráceny žádné výsledky výzkumu.