Komorbiditeter og koinfektioner i latent TB (COMBINE-TB)

Undersøgelsesdesign: Dette er en tværsnitsundersøgelse for at identificere personer med LTBI og co-infektioner/komorbiditeter: underernæring; DM; og helminth infektioner. Individer vil først blive evalueret klinisk for symptomer på aktiv TB. Personer med symptomer på aktiv TB vil blive udelukket fra undersøgelsen og henvist til behandling. Personer, der er asymptomatiske for aktiv TB, vil blive screenet for LTBI ved interferon gamma (IFNγ) frigivelsesassay (IGRA) og klinisk vurderet for underernæring (ved body mass index [BMI]), evalueret for DM status (ved hæmoglobin A1c [HbA1c] niveauer ), og evalueret for helminthinfektion (ved serologi og afførings kvantitativ polymerasekædereaktion [qPCR]).

Personer, der er berettigede, vil blive tildelt en af ​​seks undersøgelsesgrupper baseret på LTBI-status og tilstedeværelse af samtidige infektioner/komorbiditeter. Deltagerne vil have et yderligere studiebesøg inden for 6 måneder efter screening til klinisk vurdering og give blod (30 ml), urin og afføringsprøver til eksperimentelle undersøgelser og opbevaring til fremtidig forskning. Nøgle forskningsevalueringer vil omfatte genekspressionsanalyser og immunfænotypning på blodprøver.

Prøvestørrelse:

Primært mål: N=5000

Sekundært mål: N=300; n=50 for hver af følgende grupper:

1. Latent tuberkulose (TB) infektion (LTBI) og underernærede;
2. LTBI med ukontrolleret diabetes mellitus (DM);
3. LTBI med helminth-infektion;
4. LTBI med flere komorbiditeter;
5. LTBI uden komorbiditeter (LTBI+ sunde kontroller); og
6. LTBI negative sunde kontroller

Undersøgelsespopulation: Voksne og unge (14-65 år) med eller uden LTBI.

Primært mål: At estimere forekomsten af ​​underernæring, DM og helminth-infektioner hos LTBI-individer.

Sekundært mål: At bestemme effekten af ​​co-infektioner/komorbiditeter på biosignaturer af LTBI ved hjælp af RNA-sekventering (RNA-seq), proteomics, metabolomics og immunologiske assays.

Endpoints: Forekomst af underernæring, DM og helminth-infektioner hos LTBI-individer og deres virkninger på biosignaturer.

Tilmeldingen fortsætter, indtil både den samlede screeningsprøve og de 6 undersøgelsesgrupper er fuldt tilmeldt. Vi vil øge screeningsprøvestørrelsen til 6000, hvis de nødvendige undersøgelsesgruppeprøvestørrelser ikke opnås ved at screene 5000 deltagere.

Rekrutteringsplan: Screeningsfasen af ​​denne undersøgelse vil være en samfundsbaseret undersøgelse i Sydindien. Deltagerne vil blive rekrutteret fra landsbyer i Kancheepuram-distriktet, hvor ca. 50% af den voksne befolkning tester positivt for LTBI af IGRA baseret på vores tidligere undersøgelse (upublicerede data). Vi forventer også baseret på vores tidligere undersøgelse, at procentdelen af ​​den voksne befolkning, der er positiv for underernæring, er 35%, for DM er 20%, og for helminthinfektion er 20% (upublicerede data).

Folketællingen i landsbyer i Kancheepuram-distriktet opdateres årligt af lokale sundhedsarbejdere ansat af Department of Public Health og feltholdene fra NIRT i Chennai, Indien. Landsbyerne vil blive valgt i samråd med Department of Public Health i Tamil Nadu. NIRT-felthold vil uddele pjecer om undersøgelsen for at udbrede bevidstheden. Pjecen vil blive godkendt af den institutionelle etiske komité (IEC) før brug.

Kliniske evalueringer:

Fysisk undersøgelse og anamnese: Gennemgang af sygehistorie og regelmæssig fysisk undersøgelse (inklusive højde, vægt, vitale tegn) vil blive udført i screeningsfasen.

I løbet af undersøgelsesfasen vil der blive taget en komplet sygehistorie samt en regelmæssig fysisk undersøgelse med vitale tegn og antropometriske mål, herunder højde, vægt, BMI Z-score, vægt for højde Z-score, midterste overarmsomkreds, talje og abdominal. omkreds, forhold mellem talje/hofteomkreds, hudfoldtykkelse og grebstyrke og bioelektrisk impedansanalyse. Til den bioelektriske impedansanalyse vil en multifrekvens kropssammensætningsanalysator (Bodystat Quadscan 4000) blive brugt til at udlede kropssammensætningsdata. Målingerne vil blive taget med let tøj og i overensstemmelse med standardanbefalinger for udførelse af bioelektrisk impedansmåling (f.eks. konsekvent tidspunkt på dagen, tømning af urin før måling, undgå målinger kort efter et større måltid eller træning). De kropssammensætningsdata, der stammer fra kildedataene, vil være kropsfedtmasse, fedtfri masse og kropscellemasse. Det viscerale fedtindeks vil blive beregnet ud fra køn, BMI, triglycerider og HDL-kolesterol (high-density lipoprotein). Derudover vil der også blive administreret spørgeskemaer til rygning og brug af stof og alkohol, herunder estimering af Alcohol Use Disorder Identification Test (AUDIT) score.

Blodtagning: I alt 10 ml blod vil indledningsvis blive indsamlet fra hver deltager via venepunktur i screeningsfasen. Undersøgelsesfasen vil involvere yderligere 30 ml blodprøvetagning. Blod vil blive brugt til laboratorieevalueringer.

Urinopsamling: Urinprøver vil blive indsamlet og opbevaret og evalueret.

Afføringsopsamling: Afføringsprøver vil blive indsamlet i specialiserede beholdere og vil blive brugt til DNA-ekstraktion og opbevaring.

Hjemmeafføring/urinopsamling: Deltagere, der ikke kan give urin og/eller afføring ved et studiebesøg, kan give det inden for 3 dage. Undersøgelsesholdet vil give instruktioner til indsamling og opbevaring af prøverne.

Laboratorieevalueringer:

Blod opsamlet i screeningsfasen vil blive brugt til de følgende evalueringer.

1. Hæmatologi: Fuldstændig blodtælling med differential- og hæmatokritniveauer. 2. IGRA (QuantiFERON-TB Plus Gold In-Tube; Qiagen) for at bekræfte LTBI-status. 3. Biokemi: HbA1c, tilfældig blodsukker, aspartataminotransferase (AST), alaninaminotransferase (ALT), urinstof og kreatinin.

4. ELISA til at identificere og kvantificere infektion med Wuchereria bancrofti. 5. Opbevaring til fremtidig forskning. Blod opsamlet i undersøgelsesfasen vil blive brugt til følgende evalueringer.

1. Fastende glukose, HbA1c og andre biokemiske parametre.
2. Makro- og mikronæringsstofniveauer, herunder serumalbumin, C-reaktivt protein, kolesterol (total, HDL, lavdensitetslipoprotein, triglycerider), vitamin A, B6, B12, C, D og E, selen og zink.
3. For LTBI-negative individer, gentag IGRA for at bekræfte LTBI-status. Hvis testen er positiv, vil det resterende blod blive kasseret, og personen vil blive trukket tilbage fra den LTBI negative kohorte.
4. Tempus eller PAXgene rørblodindsamling til DNA- og RNA-isolering til eksperimentelle undersøgelser og opbevaring til fremtidig forskning. Ingen human genetisk testning vil blive udført under denne protokol.
5. Perifert blod mononukleær celle (PBMC) isolering til eksperimentelle undersøgelser og opbevaring til fremtidig forskning.
6. Serum vil også blive indsamlet til eksperimentelle undersøgelser og opbevaring til fremtidig forskning.

Afføringsprøver vil blive brugt til følgende evalueringer.

1. Ved screening, afførings-DNA til qPCR-diagnostik for at detektere hageorm, Ascaris, Strongyloides og Trichuris.
2. Opbevaring til fremtidig forskning.

Derudover vil urinprøver indsamlet i undersøgelsesfasen blive brugt til følgende evalueringer.

1. Proteomiske og metabolomiske undersøgelser.
2. Opbevaring til fremtidig forskning.

Resultater af kliniske evalueringer vil blive returneret til deltagerne.

Eksperimentelle undersøgelser:

Transcriptomics: Vi vil udføre RNA-seq-analyse på 50 individer i hver gruppe for at undersøge den transkriptomiske signatur. RNA vil blive ekstraheret fra Tempus eller PAXgene rør, kodet og analyseret af RNA seq. De opnåede data vil derefter blive evalueret for RNA-ekspressionsmønstre og ændringer.

Proteomics: Blod- og urinproteomik er hurtigt ved at blive et vigtigt værktøj til at fremme opdagelse af biomarkører, validering, diagnostik og andre områder. Vi vil bruge serum- og urinproteomik fra en undergruppe af individer (n=30) i hver gruppe til at udføre proteomik ved væskekromatografi med tandem massespektrometri. Bioinformatisk analyse af proteinekspression i disse grupper ville give nyttig information om proteinsignaturerne af LTBI i højrisikopopulationer.

Metabolomics: Vi vil bruge ikke-målrettet kapillær elektroforese time of flight massespektrometri til at analysere serummetaboliske profiler for en undergruppe af individer (n=30) i hver gruppe. Metabolomics vil komplementere data opnået fra proteomics.

Immunologiske analyser:

1. Definer cirkulerende immuncellepopulationsfrekvenser ved flowcytometri Vores standardiserede flowcytometripaneler, beskrevet nedenfor, vil blive anvendt på en undergruppe af individer (n=30) i hver gruppe (tabel 1). Vi vil måle frekvenser af alle større undergrupper af immunceller: monocytter, NK-celler, B-celler og T-celler, inklusive CD56+ T-celler. T-celler vil yderligere blive opdelt i konventionelle T-celler (CD4- og CD8-udtrykkende celler) og ikke-konventionelle T-celler (slimhinde-associerede invariante T-celler, NK T-celler og gamma delta T-celler). For konventionelle T-celler vil vi også fange hukommelsesfænotype og, for CD4+ T-celler, Th-undergrupperne. Vi vil udføre kvalitetskontrol ved hjælp af gentagne kørsler af prøver fra en kontroldonation for at validere prøveintegritet og kontrol for den til tider drastiske tekniske variabilitet observeret i cytometrieksperimenter. For at minimere teknisk variabilitet vil vi anvende en centraliseret gating-metode, hvor alle resultater vil blive analyseret af den samme person.
2. Definer immunsignaturerne for PBMC'er og hukommelse CD4+ og CD8+ T-celler Celler vil blive sorteret på et fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) Aria-cytometer fra en undergruppe af individer (n=20) i hver gruppe. Et minimum på 50.000 celler hver af PBMC'er og hukommelse CD4+ og CD8+ T-celler vil blive sorteret i TRIzol LS. Baseret på vores erfaring er mindst 7% af PBMC'er hukommelse CD4+ T-celler og 4% er hukommelse CD8+ T-celler. Genekspressionsprofiler for hele PBMC'er og sorterede hukommelses-T-celler vil blive opnået ved RNA-seq ved hjælp af den genom-brede ekspressionsplatform fra Illumina, hvilket giver ekspressionsniveauerne for >50.000 identificerede gener i det humane genom (inklusive ikke-proteinkodende RNA-arter). Prøvegenerering, biblioteksforberedelse, sekventering og kortlægning vil blive udført under veldefinerede og standardiserede protokoller, med kvalitetskontroltjek inkluderet i hvert større trin for at sikre datagenerering af høj kvalitet. Til genekspressionsanalyse, hvor et stort antal variabler testes samtidigt, vil vi bruge DESeq Benjamini Hochberg korrigerede p-justerede værdier på <0,05 til at identificere differentielt udtrykte gener mellem grupper. Vi vil udføre pathway-analyse af gener, der er signifikant opreguleret mellem de forskellige sammenligninger og undersøge de associerede genmoduler. Til dette formål vil vi bruge webværktøjet Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) til at bestemme, hvilke veje der er signifikant repræsenteret. Vi planlægger at bruge softwaren Ingenuity Pathway Analysis (IPA) til at bestemme mere detaljeret retningsbestemmelsen af ​​de overrepræsenterede funktioner og de fælles opstrømsregulatorer for det givne sæt gener. En komplementær tilgang vil følge en modulær analyse, der identificerer klynger af gener, der deler en lignende ekspressionsprofil. Især planlægger vi at bruge den vægtede gen-co-ekspression netværksanalyse (WGCNA) algoritme. Ved samtidig at overvåge PBMC-immuncellesammensætningen, bestemme den overordnede PBMC-genekspression og bestemme profilen af ​​hukommelse CD4+ og CD8+ T-celler, kan vi detektere sygdomsspecifikke signaturer i PBMC'er generelt og identificere bidraget fra T-celleundergrupper til disse dysreguleringer i særlig.
3. Definer antigenreaktive cellulære immunresponser ved flowcytometri Antigenreaktive cellulære immunresponser vil blive målt i en undergruppe af individer (n=20) i hver gruppe. PBMC'er vil blive stimuleret med PPD og M. tuberculosis helcellelysat i 24 timer, og antigenstimulerede cellulære immunresponser vil blive undersøgt. Vi planlægger at undersøge et panel af aktiveringsmarkører (HLA-DR, CD38, OX-40 og CD153), cytokiner (IL-2, IFNγ, TNFα, IL-17) og cytotoksiske markører (perforin, granzyme B, granulysin, CD107a) ) på alle større konventionelle og ikke-konventionelle T-celleundersæt og NK-celler.

Returnering af forskningsresultater De eksperimentelle undersøgelser forventes ikke at afsløre individuelle kliniske resultater eller medicinske tilfældige fund, der kan handles. Derfor vil ingen forskningsresultater blive returneret til deltagerne.