Comorbidità e coinfezioni nella tubercolosi latente (COMBINE-TB)

Disegno dello studio: si tratta di uno studio trasversale per identificare gli individui con LTBI e co-infezioni/comorbilità: malnutrizione; DM; e infezioni da elminti. Gli individui saranno prima valutati clinicamente per i sintomi della tubercolosi attiva. Gli individui con sintomi di tubercolosi attiva saranno esclusi dallo studio e indirizzati al trattamento. Gli individui asintomatici per tubercolosi attiva saranno sottoposti a screening per LTBI mediante test di rilascio di interferone gamma (IFNγ) (IGRA) e valutati clinicamente per la malnutrizione (in base all'indice di massa corporea [BMI]), valutati per lo stato di DM (in base ai livelli di emoglobina A1c [HbA1c] ) e valutato per l'infezione da elminti (mediante sierologia e reazione a catena della polimerasi quantitativa delle feci [qPCR]).

Gli individui idonei verranno assegnati a uno dei sei gruppi di studio in base allo stato di LTBI e alla presenza di coinfezioni/comorbilità. I partecipanti effettueranno un'ulteriore visita di studio entro 6 mesi dallo screening per la valutazione clinica e forniranno campioni di sangue (30 ml), urina e feci per studi sperimentali e conservazione per ricerche future. Le principali valutazioni della ricerca includeranno analisi dell'espressione genica e immunofenotipizzazione su campioni di sangue.

Misura di prova:

Obiettivo primario: N=5000

Obiettivo Secondario: N=300; n=50 per ciascuno dei seguenti gruppi:

1. Infezione da tubercolosi latente (TBC) (LTBI) e malnutrizione;
2. LTBI con diabete mellito non controllato (DM);
3. LTBI con infezione da elminti;
4. LTBI con molteplici comorbilità;
5. LTBI senza comorbidità (LTBI+ controlli sani); E
6. Controlli sani negativi LTBI

Popolazione in studio: adulti e adolescenti (14-65 anni di età) con o senza LTBI.

Obiettivo primario: stimare la prevalenza di malnutrizione, DM e infezioni da elminti negli individui con LTBI.

Obiettivo secondario: determinare l'effetto di coinfezioni/comorbilità sulle firme biologiche di LTBI utilizzando il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq), la proteomica, la metabolomica e i test immunologici.

Endpoint: prevalenza di malnutrizione, DM e infezioni da elminti negli individui con LTBI e loro effetti sulle firme biologiche.

L'arruolamento continuerà fino a quando sia il campione di screening totale che i 6 gruppi di studio non saranno completamente arruolati. Aumenteremo la dimensione del campione di screening a 6000 se le dimensioni del campione del gruppo di studio richieste non vengono raggiunte mediante lo screening di 5000 partecipanti.

Piano di reclutamento: la fase di screening di questo studio sarà uno studio basato sulla comunità nel sud dell'India. I partecipanti saranno reclutati dai villaggi nel distretto di Kancheepuram, dove circa il 50% della popolazione adulta risulta positiva per LTBI da IGRA sulla base del nostro studio precedente (dati non pubblicati). Prevediamo inoltre, sulla base del nostro precedente studio, che la percentuale della popolazione adulta positiva per malnutrizione è del 35%, per DM è del 20% e per infezione da elminti è del 20% (dati non pubblicati).

Il censimento nei villaggi del distretto di Kancheepuram viene aggiornato ogni anno dagli operatori sanitari locali impiegati dal Dipartimento della sanità pubblica e dalle squadre sul campo del NIRT a Chennai, in India. I villaggi saranno scelti in consultazione con il Dipartimento della sanità pubblica del Tamil Nadu. I team sul campo del NIRT distribuiranno opuscoli sullo studio per diffondere la consapevolezza. L'opuscolo sarà approvato dal Comitato Etico Istituzionale (IEC) prima dell'uso.

Valutazioni cliniche:

Esame fisico e anamnesi: durante la fase di screening verranno eseguiti revisione della storia medica e regolare esame fisico (inclusi altezza, peso, segni vitali).

Durante la fase di studio, verrà raccolta una storia medica completa, nonché un regolare esame fisico con segni vitali e misurazioni antropometriche, tra cui altezza, peso, punteggi BMI Z, punteggio Z del peso per altezza, circonferenza della parte superiore del braccio, vita e addominali circonferenza, rapporto tra circonferenza vita/fianchi, spessore della plica cutanea e forza di presa e analisi dell'impedenza bioelettrica. Per l'analisi dell'impedenza bioelettrica, verrà utilizzato un analizzatore di composizione corporea multifrequenza (Bodystat Quadscan 4000) per derivare i dati di composizione corporea. Le misurazioni saranno effettuate con indumenti leggeri e secondo le raccomandazioni standard per l'esecuzione della misurazione dell'impedenza bioelettrica (ad esempio, orario costante della giornata, minzione dell'urina prima della misurazione, evitare misurazioni subito dopo un pasto o un esercizio fisico importanti). I dati sulla composizione corporea derivati ​​dai dati di origine saranno la massa grassa corporea, la massa magra e la massa cellulare corporea. L'indice di adiposità viscerale sarà calcolato in base a sesso, BMI, trigliceridi e colesterolo HDL. Inoltre, verranno somministrati anche questionari per il fumo e l'uso di droghe e alcol, inclusa la stima dei punteggi del test di identificazione del disturbo da uso di alcol (AUDIT).

Prelievo di sangue: un totale di 10 ml di sangue verrà inizialmente raccolto da ciascun partecipante tramite prelievo venoso nella fase di screening. La fase di studio comporterà un ulteriore prelievo di sangue di 30 ml. Il sangue verrà utilizzato per le valutazioni di laboratorio.

Raccolta delle urine: i campioni di urina saranno raccolti, conservati e valutati.

Raccolta delle feci: I campioni di feci saranno raccolti in contenitori specializzati e saranno utilizzati per l'estrazione e la conservazione del DNA.

Raccolta di feci/urina a domicilio: i partecipanti che non possono fornire urina e/o feci durante una visita di studio possono fornirla entro 3 giorni. Il team dello studio fornirà le istruzioni per la raccolta e la conservazione dei campioni.

Valutazioni di laboratorio:

Il sangue raccolto durante la fase di screening verrà utilizzato per le seguenti valutazioni.

1. Ematologia: emocromo completo con livelli differenziali ed ematocrito. 2. IGRA (QuantiFERON-TB Plus Gold In-Tube; Qiagen) per confermare lo stato di LTBI. 3. Biochimica: HbA1c, glicemia casuale, aspartato aminotransferasi (AST), alanina aminotransferasi (ALT), urea e creatinina.

4. ELISA per identificare e quantificare l'infezione da Wuchereria bancrofti. 5. Archiviazione per ricerche future. Il sangue raccolto nella fase di studio verrà utilizzato per le seguenti valutazioni.

1. Glicemia a digiuno, HbA1c e altri parametri biochimici.
2. Livelli di macro e micronutrienti, tra cui albumina sierica, proteina C-reattiva, colesterolo (totale, HDL, lipoproteine ​​a bassa densità, trigliceridi), vitamine A, B6, B12, C, D ed E, selenio e zinco.
3. Per gli individui LTBI-negativi, ripetere l'IGRA per confermare lo stato LTBI. Se il test è positivo, il sangue rimanente verrà scartato e l'individuo verrà ritirato dalla coorte negativa LTBI.
4. Prelievo di sangue in provetta Tempus o PAXgene per l'isolamento di DNA e RNA per studi sperimentali e conservazione per ricerche future. Nessun test genetico umano verrà eseguito nell'ambito di questo protocollo.
5. Isolamento delle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) per studi sperimentali e conservazione per ricerche future.
6. Il siero verrà raccolto anche per studi sperimentali e conservazione per ricerche future.

I campioni di feci verranno utilizzati per le seguenti valutazioni.

1. Allo screening, DNA delle feci per la diagnostica qPCR per rilevare anchilostomi, Ascaris, Strongyloides e Trichuris.
2. Archiviazione per ricerche future.

Inoltre, i campioni di urina raccolti nella fase di studio verranno utilizzati per le seguenti valutazioni.

1. Indagini proteomiche e metabolomiche.
2. Archiviazione per ricerche future.

I risultati delle valutazioni cliniche saranno restituiti ai partecipanti.

Studi sperimentali:

Trascrittomica: eseguiremo l'analisi dell'RNA seq su 50 individui in ciascun gruppo per esaminare la firma trascrittomica. L'RNA sarà estratto da provette Tempus o PAXgene, codificato e analizzato mediante RNA seq. I dati ottenuti saranno quindi valutati per pattern di espressione e alterazioni dell'RNA.

Proteomica: la proteomica del sangue e delle urine sta rapidamente diventando uno strumento importante per far progredire la scoperta, la convalida, la diagnostica e altri campi dei biomarcatori. Useremo la proteomica del siero e dell'urina di un sottoinsieme di individui (n=30) in ciascun gruppo per eseguire la proteomica mediante cromatografia liquida con spettrometria di massa tandem. L'analisi bioinformatica dell'espressione proteica in questi gruppi fornirebbe informazioni utili sulle firme proteiche di LTBI nelle popolazioni ad alto rischio.

Metabolomica: utilizzeremo la spettrometria di massa del tempo di volo dell'elettroforesi capillare non mirata per analizzare i profili metabolici sierici di un sottogruppo di individui (n = 30) in ciascun gruppo. La metabolomica integrerà i dati ottenuti dalla proteomica.

Test immunologici:

1. Definire le frequenze della popolazione di cellule immunitarie circolanti mediante citometria a flusso I nostri pannelli di citometria a flusso standardizzati, descritti di seguito, verranno applicati a un sottoinsieme di individui (n = 30) in ciascun gruppo (Tabella 1). Misureremo le frequenze di tutti i principali sottoinsiemi di cellule immunitarie: monociti, cellule NK, cellule B e cellule T, comprese le cellule T CD56+. Le cellule T saranno ulteriormente suddivise in cellule T convenzionali (cellule che esprimono CD4 e CD8) e cellule T non convenzionali (cellule T invarianti associate alla mucosa, cellule T NK e cellule T gamma delta). Per le cellule T convenzionali, cattureremo anche il fenotipo della memoria e, per le cellule T CD4+, i sottoinsiemi Th. Effettueremo il controllo di qualità utilizzando ripetizioni di campioni da una donazione di controllo per convalidare l'integrità del campione e il controllo per la variabilità tecnica a volte drastica osservata negli esperimenti di citometria. Per ridurre al minimo la variabilità tecnica, applicheremo un metodo di gating centralizzato in cui tutti i risultati saranno analizzati dallo stesso individuo.
2. Definire le firme immunitarie delle PBMC e delle cellule T CD4+ e CD8+ di memoria Le cellule saranno ordinate su un citometro Aria con smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS) da un sottogruppo di individui (n=20) in ciascun gruppo. Un minimo di 50.000 cellule ciascuna di PBMC e cellule T di memoria CD4+ e CD8+ saranno ordinate in TRIzol LS. Sulla base della nostra esperienza, almeno il 7% delle PBMC sono cellule T CD4+ di memoria e il 4% sono cellule T CD8+ di memoria. I profili di espressione genica di PBMC intere e cellule T di memoria ordinate saranno ottenuti mediante RNA-seq utilizzando la piattaforma di espressione genome wide di Illumina, fornendo i livelli di espressione per >50.000 geni identificati nel genoma umano (comprese le specie di RNA codificanti non proteiche). La generazione del campione, la preparazione della libreria, il sequenziamento e la mappatura saranno eseguiti secondo protocolli ben definiti e standardizzati, con controlli di controllo della qualità inclusi in ogni fase principale per garantire la generazione di dati di alta qualità. Per l'analisi dell'espressione genica, in cui un numero enorme di variabili viene testato contemporaneamente, utilizzeremo i valori p-adjusted corretti DESeq Benjamini Hochberg di <0,05 per identificare i geni espressi in modo differenziale tra i gruppi. Eseguiremo analisi di pathway di geni significativamente sovraregolati tra i diversi confronti e studieremo i moduli genici associati. A tale scopo, utilizzeremo lo strumento Web Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) per determinare quali percorsi sono rappresentati in modo significativo. Intendiamo utilizzare il software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) per determinare in modo più dettagliato la direzionalità delle funzioni sovrarappresentate e i comuni regolatori a monte per il dato insieme di geni. Un approccio complementare seguirà un'analisi modulare che identifica gruppi di geni che condividono un profilo di espressione simile. In particolare, intendiamo utilizzare l'algoritmo WGCNA (Weed Gene Co-Expression Network Analysis). Monitorando simultaneamente la composizione delle cellule immunitarie delle PBMC, determinando l'espressione genica complessiva delle PBMC e determinando il profilo delle cellule T CD4+ e CD8+ di memoria, possiamo rilevare firme specifiche della malattia nelle PBMC in generale e identificare il contributo dei sottoinsiemi di cellule T a queste disregolazioni in particolare.
3. Definire le risposte immunitarie cellulari reattive all'antigene mediante citometria a flusso Le risposte immunitarie cellulari reattive all'antigene saranno misurate in un sottogruppo di individui (n=20) in ciascun gruppo. Le PBMC saranno stimolate con lisato cellulare intero di PPD e M. tuberculosis per 24 ore e saranno studiate le risposte immunitarie cellulari stimolate dall'antigene. Prevediamo di esaminare un pannello di marcatori di attivazione (HLA-DR, CD38, OX-40 e CD153), citochine (IL-2, IFNγ, TNFα, IL-17) e marcatori citotossici (perforina, granzima B, granulisina, CD107a ) su tutti i principali sottoinsiemi di cellule T convenzionali e non convenzionali e cellule NK.

Restituzione dei risultati della ricerca Non si prevede che gli studi sperimentali rivelino risultati clinici individuali o risultati accidentali perseguibili dal punto di vista medico. Pertanto, nessun risultato della ricerca verrà restituito ai partecipanti.