Comorbilidades y Coinfecciones en TB Latente (COMBINE-TB)

Diseño del estudio: Este es un estudio transversal para identificar individuos con LTBI y coinfecciones/comorbilidades: desnutrición; DM; e infecciones por helmintos. Las personas primero serán evaluadas clínicamente para detectar síntomas de TB activa. Las personas con síntomas de TB activa serán excluidas del estudio y remitidas para recibir tratamiento. A las personas asintomáticas para la TB activa se les realizará una prueba de detección de LTBI mediante el ensayo de liberación de interferón gamma (IFNγ) (IGRA) y se les evaluará clínicamente la desnutrición (por el índice de masa corporal [IMC]), se evaluará el estado de la DM (por los niveles de hemoglobina A1c [HbA1c] ), y evaluado para la infección por helmintos (mediante serología y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en heces [qPCR]).

Las personas que sean elegibles serán asignadas a uno de los seis grupos de estudio según el estado de LTBI y la presencia de coinfecciones/comorbilidades. Los participantes tendrán una visita de estudio adicional dentro de los 6 meses posteriores a la selección para la evaluación clínica y proporcionarán muestras de sangre (30 ml), orina y heces para estudios experimentales y almacenamiento para futuras investigaciones. Las evaluaciones de investigación clave incluirán análisis de expresión génica e inmunofenotipado en muestras de sangre.

Tamaño de la muestra:

Objetivo principal: N=5000

Objetivo Secundario: N=300; n=50 para cada uno de los siguientes grupos:

1. Infección latente de tuberculosis (TB) (LTBI) y desnutrición;
2. LTBI con diabetes mellitus no controlada (DM);
3. LTBI con infección por helmintos;
4. LTBI con múltiples comorbilidades;
5. LTBI sin comorbilidades (LTBI+ controles sanos); y
6. Controles sanos negativos para ITBL

Población de estudio: Adultos y adolescentes (14-65 años) con o sin LTBI.

Objetivo Primario: Estimar la prevalencia de desnutrición, DM y helmintos en individuos con ITBL.

Objetivo secundario: Determinar el efecto de las coinfecciones/comorbilidades en las firmas biológicas de LTBI mediante secuenciación de ARN (RNA-seq), proteómica, metabolómica y ensayos inmunológicos.

Criterios de valoración: Prevalencia de desnutrición, DM e infecciones por helmintos en individuos con LTBI y sus efectos en las firmas biológicas.

La inscripción continuará hasta que tanto la muestra de selección total como los 6 grupos de estudio estén completamente inscritos. Aumentaremos el tamaño de la muestra de selección a 6000 si los tamaños de muestra del grupo de estudio requeridos no se logran mediante la selección de 5000 participantes.

Plan de reclutamiento: la fase de selección de este estudio será un estudio comunitario en el sur de la India. Los participantes serán reclutados de aldeas en el distrito de Kancheepuram, donde aproximadamente el 50% de la población adulta da positivo para LTBI por IGRA según nuestro estudio anterior (datos no publicados). También anticipamos con base en nuestro estudio anterior que el porcentaje de la población adulta positiva para desnutrición es del 35%, para DM es del 20% y para la infección por helmintos es del 20% (datos no publicados).

El censo en las aldeas del distrito de Kancheepuram es actualizado anualmente por trabajadores de la salud locales empleados por el Departamento de Salud Pública y los equipos de campo del NIRT en Chennai, India. Los pueblos se elegirán en consulta con el Departamento de Salud Pública de Tamil Nadu. Los equipos de campo de NIRT distribuirán folletos sobre el estudio para difundir la conciencia. El folleto será aprobado por el Comité de Ética Institucional (CEI) previo a su uso.

Evaluaciones clínicas:

Examen físico e historial: En la fase de selección se realizará una revisión del historial médico y un examen físico regular (que incluya altura, peso, signos vitales).

Durante la fase de estudio, se tomará un historial médico completo, así como un examen físico regular con signos vitales y medidas antropométricas, que incluyen estatura, peso, puntajes Z de IMC, puntajes Z de peso para estatura, circunferencia del brazo medio, cintura y abdomen. circunferencia, relación de circunferencia de cintura/cadera, grosor de pliegues cutáneos y fuerza de agarre, y análisis de impedancia bioeléctrica. Para el análisis de impedancia bioeléctrica, se utilizará un analizador de composición corporal multifrecuencia (Bodystat Quadscan 4000) para obtener datos de composición corporal. Las mediciones se realizarán con ropa ligera y de acuerdo con las recomendaciones estándar para la realización de mediciones de impedancia bioeléctrica (p. ej., hora constante del día, orinar antes de la medición, evitar mediciones poco después de una comida importante o ejercicio). Los datos de composición corporal derivados de los datos de origen serán la masa de grasa corporal, la masa libre de grasa y la masa de células corporales. El índice de adiposidad visceral se calculará en función del sexo, el IMC, los triglicéridos y el colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL). Además, también se administrarán cuestionarios para el uso de tabaco y drogas y alcohol, incluida la estimación de los puntajes de la Prueba de identificación del trastorno por uso de alcohol (AUDIT).

Extracción de sangre: Se recolectará inicialmente un total de 10 ml de sangre de cada participante mediante venopunción en la fase de selección. La fase de estudio implicará una extracción de sangre adicional de 30 ml. La sangre se utilizará para las evaluaciones de laboratorio.

Recolección de orina: Se recolectarán, almacenarán y evaluarán muestras de orina.

Recolección de heces: Las muestras de heces se recolectarán en contenedores especializados y se utilizarán para la extracción y el almacenamiento de ADN.

Recolección de heces/orina en el hogar: los participantes que no puedan proporcionar orina o heces en una visita del estudio pueden hacerlo en un plazo de 3 días. El equipo de estudio proporcionará instrucciones para la recolección y el almacenamiento de las muestras.

Evaluaciones de laboratorio:

La sangre recolectada en la fase de selección se utilizará para las siguientes evaluaciones.

1. Hematología: Hemograma completo con diferencial y niveles de hematocrito. 2. IGRA (QuantiFERON-TB Plus Gold In-Tube; Qiagen) para confirmar el estado de LTBI. 3. Bioquímica: HbA1c, glucemia aleatoria, aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), urea y creatinina.

4. ELISA para identificar y cuantificar la infección por Wuchereria bancrofti. 5. Almacenamiento para futuras investigaciones. La sangre recolectada en la fase de estudio se utilizará para las siguientes evaluaciones.

1. Glucosa en ayunas, HbA1c y otros parámetros bioquímicos.
2. Niveles de macro y micronutrientes, que incluyen albúmina sérica, proteína C reactiva, colesterol (total, HDL, lipoproteína de baja densidad, triglicéridos), vitaminas A, B6, B12, C, D y E, selenio y zinc.
3. Para personas con LTBI negativo, repita IGRA para confirmar el estado de LTBI. Si la prueba es positiva, la sangre restante se desechará y el individuo se retirará de la cohorte negativa de LTBI.
4. Recolección de sangre en tubos Tempus o PAXgene para aislamiento de ADN y ARN para estudios experimentales y almacenamiento para futuras investigaciones. No se realizarán pruebas genéticas en humanos bajo este protocolo.
5. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para estudios experimentales y almacenamiento para futuras investigaciones.
6. El suero también se recolectará para estudios experimentales y almacenamiento para futuras investigaciones.

Las muestras de heces se utilizarán para las siguientes evaluaciones.

1. En la selección, ADN de heces para diagnósticos de qPCR para detectar anquilostomas, Ascaris, Strongyloides y Trichuris.
2. Almacenamiento para futuras investigaciones.

Además, las muestras de orina recolectadas en la fase de estudio se utilizarán para las siguientes evaluaciones.

1. Investigaciones proteómicas y metabolómicas.
2. Almacenamiento para futuras investigaciones.

Los resultados de las evaluaciones clínicas se devolverán a los participantes.

Estudios experimentales:

Transcriptómica: realizaremos análisis de secuencias de ARN en 50 personas de cada grupo para examinar la firma transcriptómica. El ARN se extraerá de los tubos Tempus o PAXgene, se codificará y analizará mediante RNA seq. Luego, los datos obtenidos se evaluarán en busca de alteraciones y patrones de expresión de ARN.

Proteómica: la proteómica de la sangre y la orina se está convirtiendo rápidamente en una herramienta importante para avanzar en el descubrimiento, la validación, el diagnóstico y otros campos de biomarcadores. Usaremos proteómica de suero y orina de un subconjunto de individuos (n=30) en cada grupo para realizar proteómica por cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem. El análisis bioinformático de la expresión de proteínas en estos grupos proporcionaría información útil sobre las firmas de proteínas de LTBI en poblaciones de alto riesgo.

Metabolómica: Utilizaremos espectrometría de masas de tiempo de vuelo de electroforesis capilar no dirigida para analizar los perfiles metabólicos séricos de un subconjunto de individuos (n=30) en cada grupo. La metabolómica complementará los datos obtenidos de la proteómica.

Ensayos inmunológicos:

1. Defina las frecuencias de población de células inmunitarias circulantes mediante citometría de flujo Nuestros paneles de citometría de flujo estandarizados, que se describen a continuación, se aplicarán a un subconjunto de individuos (n=30) en cada grupo (Tabla 1). Mediremos las frecuencias de todos los principales subconjuntos de células inmunitarias: monocitos, células NK, células B y células T, incluidas las células T CD56+. Las células T se dividirán además en células T convencionales (células que expresan CD4 y CD8) y células T no convencionales (células T invariantes asociadas a la mucosa, células T NK y células T gamma delta). Para las células T convencionales, también capturaremos el fenotipo de memoria y, para las células T CD4+, los subconjuntos Th. Realizaremos el control de calidad utilizando muestras repetidas de una donación de control para validar la integridad de la muestra y el control de la variabilidad técnica, a veces drástica, observada en los experimentos de citometría. Para minimizar la variabilidad técnica, aplicaremos un método de selección centralizado donde todos los resultados serán analizados por la misma persona.
2. Definir las firmas inmunitarias de las PBMC y las células T CD4+ y CD8+ de memoria Las células se clasificarán en un citómetro Aria de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de un subconjunto de individuos (n=20) en cada grupo. Un mínimo de 50 000 células de cada una de las PBMC y las células T CD4+ y CD8+ de memoria se clasificarán en TRIzol LS. Según nuestra experiencia, al menos el 7 % de las PBMC son células T CD4+ de memoria y el 4 % son células T CD8+ de memoria. Los perfiles de expresión génica de las PBMC completas y las células T de memoria clasificadas se obtendrán mediante RNA-seq utilizando la plataforma de expresión de todo el genoma de Illumina, que proporciona los niveles de expresión para >50 000 genes identificados en el genoma humano (incluidas las especies de ARN que no codifican proteínas). La generación de muestras, la preparación de bibliotecas, la secuenciación y el mapeo se realizarán según protocolos estandarizados y bien definidos, con controles de calidad incluidos en cada paso importante para garantizar una generación de datos de alta calidad. Para el análisis de la expresión génica, en el que se prueba simultáneamente una gran cantidad de variables, utilizaremos los valores ajustados de p corregidos de DESeq Benjamini Hochberg de <0,05 para identificar genes expresados ​​diferencialmente entre grupos. Realizaremos análisis de vías de genes significativamente regulados al alza entre las diferentes comparaciones e investigaremos los módulos de genes asociados. Para ello, utilizaremos la herramienta web Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) para determinar qué vías están significativamente representadas. Planeamos utilizar el software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) para determinar con más detalle la direccionalidad de las funciones sobrerrepresentadas y los reguladores aguas arriba comunes para el conjunto de genes dado. Un enfoque complementario seguirá un análisis modular que identifica grupos de genes que comparten un perfil de expresión similar. En particular, planeamos utilizar el algoritmo de análisis de red de coexpresión de genes ponderados (WGCNA). Al monitorear simultáneamente la composición de las células inmunitarias de las PBMC, determinar la expresión génica general de las PBMC y determinar el perfil de las células T CD4+ y CD8+ de memoria, podemos detectar firmas específicas de enfermedades en las PBMC en general e identificar la contribución de los subconjuntos de células T a estas desregulaciones en particular.
3. Definir respuestas inmunitarias celulares reactivas al antígeno mediante citometría de flujo Las respuestas inmunitarias celulares reactivas al antígeno se medirán en un subconjunto de individuos (n=20) en cada grupo. Las PBMC se estimularán con PPD y lisado de células enteras de M. tuberculosis durante 24 horas y se estudiarán las respuestas inmunitarias celulares estimuladas por antígenos. Planeamos examinar un panel de marcadores de activación (HLA-DR, CD38, OX-40 y CD153), citocinas (IL-2, IFNγ, TNFα, IL-17) y marcadores citotóxicos (perforina, granzima B, granulisina, CD107a ) en todos los principales subconjuntos de células T convencionales y no convencionales y células NK.

Devolución de los resultados de la investigación No se espera que los estudios experimentales revelen resultados clínicos individuales o hallazgos incidentales procesables médicamente. Por lo tanto, ningún resultado de la investigación será devuelto a los participantes.