Sairaudet ja rinnakkaisinfektiot piilevässä tuberkuloosissa (COMBINE-TB)

Tutkimuksen suunnittelu: Tämä on poikkileikkaustutkimus henkilöiden tunnistamiseksi, joilla on LTBI ja muita infektioita/yhteissairauksia: aliravitsemus; DM; ja helmintti-infektiot. Yksilöt arvioidaan ensin kliinisesti aktiivisen tuberkuloosin oireiden varalta. Henkilöt, joilla on aktiivisen tuberkuloosin oireita, suljetaan pois tutkimuksesta ja lähetetään hoitoon. Henkilöt, jotka ovat oireettomia aktiivisen tuberkuloosin suhteen, seulotaan LTBI:n varalta gamma-interferonin (IFNγ) vapautumismäärityksellä (IGRA) ja kliinisesti arvioidaan aliravitsemuksen varalta (painoindeksin [BMI] perusteella) ja DM-statuksen suhteen (hemoglobiini A1c [HbA1c] -tasoilla). ) ja arvioitiin helminttiinfektion varalta (serologialla ja ulosteen kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla [qPCR]).

Henkilöt, jotka ovat kelvollisia, määrätään johonkin kuudesta tutkimusryhmästä LTBI-statuksen ja muiden infektioiden/yhteissairauksien esiintymisen perusteella. Osallistujat saavat lisätutkimusvierailun 6 kuukauden kuluessa seulonnasta kliinistä arviointia varten, ja he toimittavat veri- (30 ml), virtsa- ja ulostenäytteitä kokeellisia tutkimuksia varten ja varastoinnin tulevaa tutkimusta varten. Keskeisiä tutkimusarviointeja ovat geeniekspressioanalyysit ja immunofenotyypitykset verinäytteistä.

Otoskoko:

Ensisijainen tavoite: N = 5000

Toissijainen tavoite: N=300; n = 50 jokaiselle seuraavista ryhmistä:

1. Piilevä tuberkuloosi (TB) -infektio (LTBI) ja aliravittu;
2. LTBI, jolla on hallitsematon diabetes mellitus (DM);
3. LTBI, jossa on helminttitulehdus;
4. LTBI, jolla on useita samanaikaisia ​​​​sairauksia;
5. LTBI ilman liitännäissairauksia (LTBI+ terveet kontrollit); ja
6. LTBI-negatiiviset terveet kontrollit

Tutkimuspopulaatio: Aikuiset ja nuoret (14-65-vuotiaat), joilla on tai ei ole LTBI:tä.

Ensisijainen tavoite: Arvioida aliravitsemuksen, DM- ja helminttiinfektioiden esiintyvyys LTBI-henkilöillä.

Toissijainen tavoite: Määrittää koinfektioiden/yhteissairauksien vaikutus LTBI:n biosignatuureihin käyttämällä RNA-sekvensointia (RNA-seq), proteomiikkaa, metabolomiikkaa ja immunologisia määrityksiä.

Päätepisteet: Aliravitsemuksen, DM- ja helminttiinfektioiden esiintyvyys LTBI-henkilöillä ja niiden vaikutukset biosignatuureihin.

Ilmoittautuminen jatkuu, kunnes sekä koko seulontanäyte että 6 tutkimusryhmää ovat täysin ilmoittautuneet. Kasvatamme seulontaotoskoon 6000:een, jos vaadittuja tutkimusryhmäotoskokoja ei saavuteta 5000 osallistujan seulonnalla.

Rekrytointisuunnitelma: Tämän tutkimuksen seulontavaihe on yhteisöpohjainen tutkimus Etelä-Intiassa. Osallistujat rekrytoidaan Kancheepuramin piirin kylistä, joissa noin 50 % aikuisväestöstä antaa IGRA:n LTBI-testin positiiviseksi aikaisemman tutkimuksemme perusteella (julkaisemattomat tiedot). Odotamme myös aikaisemman tutkimuksemme perusteella, että aliravitsemuspositiivisten aikuisväestöjen prosenttiosuus on 35 %, DM on 20 % ja helminttiinfektio 20 % (julkaisematon tieto).

Kancheepuramin piirin kylien väestölaskentaa päivittävät vuosittain kansanterveysministeriön ja Intian Chennain NIRT:n kenttätyöntekijät. Kylät valitaan yhteistyössä Tamil Nadun kansanterveysministeriön kanssa. NIRT-kenttäryhmät jakavat tutkimuksesta esitteitä tietoisuuden lisäämiseksi. Institutional Ethics Committee (IEC) hyväksyy esitteen ennen käyttöä.

Kliiniset arvioinnit:

Fyysinen tarkastus ja historia: Seulontavaiheessa suoritetaan sairaushistorian tarkastelu ja säännöllinen fyysinen tarkastus (mukaan lukien pituus, paino, elintoiminnot).

Opintojakson aikana otetaan täydellinen sairaushistoria sekä säännöllinen fyysinen tarkastus elintoimintojen ja antropometristen mittausten kanssa, mukaan lukien pituus, paino, BMI Z-pisteet, paino pituuden Z-pisteet, olkavarren keskimmäinen ympärysmitta, vyötärö ja vatsa. ympärysmitta, vyötärön/lantion ympärysmitan suhde, ihopoimujen paksuus ja pitovoima sekä biosähköinen impedanssianalyysi. Biosähköisen impedanssin analyysissä käytetään monitaajuista kehonkoostumusanalysaattoria (Bodystat Quadscan 4000) kehonkoostumustietojen johtamiseen. Mittaukset tehdään kevyissä vaatteissa ja biosähköisen impedanssin mittauksen suorittamista koskevien standardisuositusten mukaisesti (esim. tasainen kellonaika, virtsan tyhjennys ennen mittausta, mittausten välttäminen pian suuren aterian tai harjoituksen jälkeen). Lähdetiedoista johdetut kehonkoostumustiedot ovat kehon rasvamassaa, rasvatonta massaa ja kehon solumassaa. Viskeraalinen rasvaisuusindeksi lasketaan sukupuolen, BMI:n, triglyseridien ja HDL-kolesterolin perusteella. Lisäksi suoritetaan kyselylomakkeita tupakoinnista sekä huumeiden ja alkoholin käytöstä, mukaan lukien alkoholinkäyttöhäiriöiden tunnistamistestin (AUDIT) tulosten arvioiminen.

Verenotto: Seulontavaiheessa jokaiselta osallistujalta otetaan aluksi yhteensä 10 ml verta laskimopunktiolla. Tutkimusvaiheeseen kuuluu lisäksi 30 ml:n verenotto. Laboratorioarviointiin käytetään verta.

Virtsan kerääminen: Virtsanäytteet kerätään, säilytetään ja arvioidaan.

Ulostekeräys: Ulostenäytteet kerätään erikoissäiliöihin ja niitä käytetään DNA:n erottamiseen ja säilytykseen.

Ulosteiden/virtsan keräys kotona: Osallistujat, jotka eivät voi tarjota virtsaa ja/tai ulostetta opintokäynnillä, voivat toimittaa sen 3 päivän kuluessa. Tutkimusryhmä antaa ohjeet näytteiden keräämiseen ja säilytykseen.

Laboratorioarvioinnit:

Seulontavaiheessa kerättyä verta käytetään seuraaviin arviointeihin.

1. Hematologia: Täydellinen verenkuva erotus- ja hematokriittitasoilla. 2. IGRA (QuantiFERON-TB Plus Gold In-Tube; Qiagen) LTBI-tilan vahvistamiseksi. 3. Biokemia: HbA1c, satunnainen verensokeri, aspartaattiaminotransferaasi (AST), alaniiniaminotransferaasi (ALT), urea ja kreatiniini.

4. ELISA Wuchereria bancrofti -infektion tunnistamiseksi ja kvantifioimiseksi. 5. Varastointi tulevaa tutkimusta varten. Tutkimusvaiheessa kerättyä verta käytetään seuraaviin arviointeihin.

1. Paastoglukoosi, HbA1c ja muut biokemialliset parametrit.
2. Makro- ja hivenravinnetasot, mukaan lukien seerumin albumiini, C-reaktiivinen proteiini, kolesteroli (kokonais-, HDL, matalatiheyksinen lipoproteiini, triglyseridit), A-, B6-, B12-, C-, D- ja E-vitamiinit, seleeni ja sinkki.
3. LTBI-negatiivisten henkilöiden kohdalla toista IGRA vahvistaaksesi LTBI-tilan. Jos testi on positiivinen, jäljellä oleva veri hylätään ja henkilö poistetaan LTBI-negatiivisesta kohortista.
4. Tempus- tai PAXgene-putkiverenotto DNA- ja RNA-eristykseen kokeellisiin tutkimuksiin ja säilytykseen tulevaa tutkimusta varten. Ihmisen geneettistä testausta ei tehdä tämän protokollan mukaisesti.
5. Perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC) eristys kokeellisiin tutkimuksiin ja varastointiin tulevaa tutkimusta varten.
6. Seerumia kerätään myös kokeellisia tutkimuksia varten ja säilytetään tulevaa tutkimusta varten.

Ulostenäytteitä käytetään seuraavissa arvioinneissa.

1. Seulonnassa uloste-DNA qPCR-diagnostiikkaa varten hakamatojen, Ascariksen, Strongyloidesin ja Trichuriksen havaitsemiseksi.
2. Säilytys tulevaa tutkimusta varten.

Lisäksi tutkimusvaiheessa kerättyjä virtsanäytteitä käytetään seuraaviin arviointeihin.

1. Proteomiset ja metabolomitutkimukset.
2. Säilytys tulevaa tutkimusta varten.

Kliinisten arviointien tulokset palautetaan osallistujille.

Kokeelliset tutkimukset:

Transkriptomiikka: Suoritamme RNA-sekvenssianalyysin 50 yksilölle kussakin ryhmässä transkriptomisen allekirjoituksen tutkimiseksi. RNA uutetaan Tempus- tai PAXgene-putkista, koodataan ja analysoidaan RNA-seq. Saaduista tiedoista arvioidaan sitten RNA:n ilmentymismallit ja muutokset.

Proteomiikka: Veren ja virtsan proteomiikasta on nopeasti tulossa tärkeä työkalu biomarkkerien löytämisen, validoinnin, diagnostiikan ja muiden alojen edistämisessä. Käytämme seerumin ja virtsan proteomiikkaa yksilöiden alajoukosta (n=30) kussakin ryhmässä suorittaaksemme proteomiikan nestekromatografialla tandem-massaspektrometrialla. Proteiinin ilmentymisen bioinformaattinen analyysi näissä ryhmissä antaisi hyödyllistä tietoa LTBI:n proteiinisignatuureista korkean riskin populaatioissa.

Aineenvaihdunta: Käytämme ei-kohdennettua kapillaarielektroforeesia lentomassaspektrometrialla analysoidaksemme yksilöiden alajoukon (n=30) seerumin metaboliaprofiileja kussakin ryhmässä. Metabolomiikka täydentää proteomiikasta saatuja tietoja.

Immunologiset määritykset:

1. Määrittele kiertävien immuunisolupopulaatioiden tiheydet virtaussytometrialla Alla kuvattuja standardoituja virtaussytometriapaneelejamme sovelletaan yksilöiden alaryhmään (n=30) kussakin ryhmässä (taulukko 1). Mittaamme kaikkien tärkeimpien immuunisolujen alajoukkojen frekvenssit: monosyytit, NK-solut, B-solut ja T-solut, mukaan lukien CD56+ T-solut. T-solut jaetaan edelleen tavanomaisiin T-soluihin (CD4- ja CD8-ilmentyvät solut) ja ei-tavanomaisiin T-soluihin (limakalvoon liittyvät muuttumattomat T-solut, NK-T-solut ja gamma-delta-T-solut). Perinteisille T-soluille sieppaamme myös muistifenotyypin ja CD4+ T-soluille Th-alajoukot. Suoritamme laadunvalvonnan käyttämällä toistuvia näytteitä kontrollilahjoitukselta vahvistaaksemme näytteen eheyden ja sytometriakokeissa havaitun toisinaan rajun teknisen vaihtelun. Teknisen vaihtelun minimoimiseksi käytämme keskitettyä portiointimenetelmää, jossa sama henkilö analysoi kaikki tulokset.
2. Määritä PBMC:iden ja muistin CD4+- ja CD8+ T-solujen immuuniallekirjoitukset Solut lajitellaan fluoresenssiaktivoidulla solulajittelulla (FACS) Aria-sytometrillä kunkin ryhmän yksilöiden alajoukosta (n=20). Vähintään 50 000 solua kukin PBMC-soluista ja muisti-CD4+- ja CD8+-T-soluista lajitellaan TRIzol LS:ään. Kokemuksemme perusteella vähintään 7 % PBMC-soluista on muisti-CD4+ T-soluja ja 4 % muisti-CD8+ T-soluja. Kokonaisten PBMC-solujen ja lajiteltujen muisti-T-solujen geeniekspressioprofiilit saadaan RNA-seq:llä käyttämällä Illuminan genominlaajuista ilmentymisalustaa, mikä tarjoaa ilmentymistasot >50 000 tunnistetulle geenille ihmisen genomissa (mukaan lukien ei-proteiinia koodaavat RNA-lajit). Näytteiden luominen, kirjaston valmistelu, sekvensointi ja kartoitus suoritetaan tarkoin määriteltyjen ja standardoitujen protokollien mukaisesti, ja jokaisessa tärkeässä vaiheessa on laadunvalvontatarkistuksia korkealaatuisen tiedon luomisen varmistamiseksi. Geeniekspressio-analyysissä, jossa testataan valtava määrä muuttujia samanaikaisesti, käytämme DESeq Benjamini Hochbergin korjattuja p-sovitettuja arvoja <0,05 tunnistaaksemme eri tavalla ilmentyneet geenit ryhmien välillä. Suoritamme reittianalyysin geeneistä, jotka ovat merkittävästi lisääntyneet eri vertailujen välillä, ja tutkimme niihin liittyviä geenimoduuleja. Tätä tarkoitusta varten käytämme verkkotyökalua Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) määrittääksemme, mitkä reitit ovat merkittävästi edustettuina. Aiomme käyttää Ingenuity Pathway Analysis (IPA) -ohjelmistoa määrittääksemme yksityiskohtaisemmin yliedustettujen toimintojen suunnan ja yleiset ylävirran säätimet tietylle geenijoukolle. Täydentävä lähestymistapa seuraa modulaarista analyysiä, joka tunnistaa geeniklustereita, joilla on samanlainen ilmentymisprofiili. Erityisesti aiomme käyttää painotettua geenikoekspressioverkkoanalyysin (WGCNA) algoritmia. Seuraamalla samanaikaisesti PBMC-immuunisolukoostumusta, määrittämällä PBMC-geenin kokonaisekspression ja määrittämällä muisti-CD4+- ja CD8+-T-solujen profiilin voimme havaita tautikohtaisia ​​allekirjoituksia PBMC-soluissa yleensä ja tunnistaa T-solualaryhmien osuuden näihin säätelyhäiriöihin. tietty.
3. Määritä antigeenireaktiiviset sellulaariset immuunivasteet virtaussytometrialla Antigeenireaktiiviset soluimmuunivasteet mitataan yksilöiden alajoukossa (n=20) kussakin ryhmässä. PBMC:itä stimuloidaan PPD:llä ja M. tuberculosis -kokosolulysaatilla 24 tunnin ajan ja antigeenistimuloituja solujen immuunivasteita tutkitaan. Aiomme tutkia paneelin aktivaatiomarkkereita (HLA-DR, CD38, OX-40 ja CD153), sytokiinejä (IL-2, IFNy, TNFα, IL-17) ja sytotoksisia markkereita (perforiini, grantsyymi B, granulysiini, CD107a) ) kaikissa tärkeimmissä tavanomaisissa ja ei-tavanomaisissa T-solualaryhmissä ja NK-soluissa.

Tutkimustulosten palautus Kokeellisten tutkimusten ei odoteta paljastavan yksittäisiä kliinisiä tuloksia tai lääketieteellisesti toteutettavissa olevia satunnaisia ​​löydöksiä. Siksi tutkimustuloksia ei palauteta osallistujille.