Komorbiditäten und Koinfektionen bei latenter TB (COMBINE-TB)

Studiendesign: Dies ist eine Querschnittsstudie zur Identifizierung von Personen mit LTBI und Koinfektionen/Komorbiditäten: Unterernährung; DM; und Wurminfektionen. Die Personen werden zunächst klinisch auf Symptome einer aktiven TB untersucht. Personen mit Symptomen einer aktiven TB werden von der Studie ausgeschlossen und zur Behandlung überwiesen. Personen, die asymptomatisch für aktive TB sind, werden mit dem Interferon-Gamma (IFNγ)-Freisetzungstest (IGRA) auf LTBI untersucht und klinisch auf Unterernährung (nach Body-Mass-Index [BMI]) und auf DM-Status (nach Hämoglobin A1c [HbA1c]-Spiegeln) untersucht ) und auf Helmintheninfektion untersucht (durch Serologie und quantitative Polymerase-Kettenreaktion im Stuhl [qPCR]).

Geeignete Personen werden basierend auf dem LTBI-Status und dem Vorhandensein von Koinfektionen/Komorbiditäten einer von sechs Studiengruppen zugeordnet. Die Teilnehmer erhalten innerhalb von 6 Monaten nach dem Screening einen zusätzlichen Studienbesuch für die klinische Bewertung und stellen Blut- (30 ml), Urin- und Stuhlproben für experimentelle Studien und zur Aufbewahrung für zukünftige Forschung zur Verfügung. Zu den wichtigsten Forschungsauswertungen gehören Genexpressionsanalysen und Immunphänotypisierung von Blutproben.

Probengröße:

Primäres Ziel: N=5000

Sekundärziel: N=300; n=50 für jede der folgenden Gruppen:

1. Latente Tuberkulose (TB)-Infektion (LTBI) und Unterernährung;
2. LTBI mit unkontrolliertem Diabetes mellitus (DM);
3. LTBI mit Wurminfektion;
4. LTBI mit mehreren Komorbiditäten;
5. LTBI ohne Komorbiditäten (LTBI+ gesunde Kontrollen); Und
6. LTBI-negative gesunde Kontrollen

Studienpopulation: Erwachsene und Jugendliche (14-65 Jahre) mit oder ohne LTBI.

Primäres Ziel: Abschätzung der Prävalenz von Unterernährung, DM und Wurminfektionen bei LTBI-Personen.

Sekundäres Ziel: Bestimmung der Wirkung von Koinfektionen/Komorbiditäten auf Biosignaturen von LTBI unter Verwendung von RNA-Sequenzierung (RNA-seq), Proteomik, Metabolomik und immunologischen Assays.

Endpunkte: Prävalenz von Unterernährung, DM und Wurminfektionen bei LTBI-Personen und ihre Auswirkungen auf Biosignaturen.

Die Einschreibung wird fortgesetzt, bis sowohl die gesamte Screening-Stichprobe als auch die 6 Studiengruppen vollständig eingeschrieben sind. Wir werden die Screening-Stichprobengröße auf 6000 erhöhen, wenn die erforderliche Stichprobengröße der Studiengruppe durch das Screening von 5000 Teilnehmern nicht erreicht wird.

Rekrutierungsplan: Die Screening-Phase dieser Studie wird eine gemeindebasierte Studie in Südindien sein. Die Teilnehmer werden aus Dörfern im Distrikt Kancheepuram rekrutiert, wo etwa 50 % der erwachsenen Bevölkerung gemäß unserer früheren Studie (unveröffentlichte Daten) von IGRA positiv auf LTBI getestet wurden. Auf der Grundlage unserer früheren Studie gehen wir auch davon aus, dass der Prozentsatz der erwachsenen Bevölkerung, die positiv auf Unterernährung sind, 35 % beträgt, 20 % für DM und 20 % für Helmintheninfektion (unveröffentlichte Daten).

Die Volkszählung in den Dörfern im Kancheepuram-Distrikt wird jährlich von lokalen Gesundheitshelfern aktualisiert, die vom Ministerium für öffentliche Gesundheit und den Außendienstteams des NIRT in Chennai, Indien, beschäftigt sind. Die Dörfer werden in Absprache mit dem Gesundheitsministerium von Tamil Nadu ausgewählt. NIRT-Feldteams werden Broschüren über die Studie verteilen, um das Bewusstsein zu schärfen. Die Broschüre wird vor der Verwendung vom Institutional Ethics Committee (IEC) genehmigt.

Klinische Bewertungen:

Körperliche Untersuchung und Anamnese: In der Screening-Phase werden eine Überprüfung der Krankengeschichte und eine regelmäßige körperliche Untersuchung (einschließlich Größe, Gewicht, Vitalzeichen) durchgeführt.

Während der Studienphase wird eine vollständige Anamnese erhoben, sowie eine regelmäßige körperliche Untersuchung mit Vitalparametern und anthropometrischen Messungen, einschließlich Größe, Gewicht, BMI Z-Scores, Gewicht für Körpergröße Z-Scores, mittlerer Oberarmumfang, Taille und Bauch Umfang, Verhältnis Taillen-/Hüftumfang, Hautfaltendicke und Griffstärke sowie bioelektrische Impedanzanalyse. Für die bioelektrische Impedanzanalyse wird ein Multifrequenz-Körperanalysegerät (Bodystat Quadscan 4000) verwendet, um Daten zur Körperzusammensetzung abzuleiten. Die Messungen werden mit leichter Kleidung und gemäß den Standardempfehlungen für die Durchführung der bioelektrischen Impedanzmessung durchgeführt (z. B. konsistente Tageszeit, Urinabgang vor der Messung, Vermeidung von Messungen kurz nach einer größeren Mahlzeit oder körperlicher Betätigung). Die aus den Quelldaten abgeleiteten Körperzusammensetzungsdaten sind Körperfettmasse, fettfreie Masse und Körperzellmasse. Der viszerale Adipositasindex wird basierend auf Geschlecht, BMI, Triglyceriden und High-Density-Lipoprotein (HDL)-Cholesterin berechnet. Darüber hinaus werden auch Fragebögen zum Rauchen sowie zum Drogen- und Alkoholkonsum, einschließlich der Schätzung der Ergebnisse des Alcohol Use Disorder Identification Test (AUDIT), durchgeführt.

Blutentnahme: In der Screening-Phase werden jedem Teilnehmer zunächst insgesamt 10 ml Blut per Venenpunktion entnommen. Die Studienphase umfasst eine zusätzliche 30-ml-Blutentnahme. Blut wird für Laboruntersuchungen verwendet.

Urinsammlung: Urinproben werden gesammelt und aufbewahrt und ausgewertet.

Stuhlsammlung: Stuhlproben werden in Spezialbehältern gesammelt und zur DNA-Extraktion und -Lagerung verwendet.

Stuhl-/Urinsammlung zu Hause: Teilnehmer, die bei einem Studienbesuch keinen Urin und/oder Stuhl abgeben können, können dies innerhalb von 3 Tagen tun. Das Studienteam gibt Anweisungen für die Entnahme und Lagerung der Proben.

Laborauswertungen:

Das in der Screening-Phase gesammelte Blut wird für die folgenden Auswertungen verwendet.

1. Hämatologie: Komplettes Blutbild mit Differential- und Hämatokritwert. 2. IGRA (QuantiFERON-TB Plus Gold In-Tube; Qiagen) zur Bestätigung des LTBI-Status. 3. Biochemie: HbA1c, zufälliger Blutzucker, Aspartat-Aminotransferase (AST), Alanin-Aminotransferase (ALT), Harnstoff und Kreatinin.

4. ELISA zur Identifizierung und Quantifizierung einer Infektion mit Wuchereria bancrofti. 5. Speicherung für zukünftige Forschung. Das in der Studienphase gesammelte Blut wird für die folgenden Auswertungen verwendet.

1. Nüchternglukose, HbA1c und andere biochemische Parameter.
2. Makro- und Mikronährstoffspiegel, einschließlich Serumalbumin, C-reaktives Protein, Cholesterin (gesamt, HDL, Low-Density-Lipoprotein, Triglyceride), Vitamine A, B6, B12, C, D und E, Selen und Zink.
3. Wiederholen Sie bei LTBI-negativen Personen IGRA, um den LTBI-Status zu bestätigen. Wenn der Test positiv ist, wird das verbleibende Blut verworfen und die Person aus der LTBI-negativen Kohorte genommen.
4. Tempus- oder PAXgene-Röhrchen-Blutentnahme zur DNA- und RNA-Isolierung für experimentelle Studien und Lagerung für zukünftige Forschung. Im Rahmen dieses Protokolls werden keine humangenetischen Tests durchgeführt.
5. Isolierung peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC) für experimentelle Studien und Lagerung für zukünftige Forschung.
6. Serum wird auch für experimentelle Studien und Lagerung für zukünftige Forschung gesammelt.

Stuhlproben werden für die folgenden Bewertungen verwendet.

1. Beim Screening Stuhl-DNA für die qPCR-Diagnostik zum Nachweis von Hakenwürmern, Ascaris, Strongyloides und Trichuris.
2. Speicher für zukünftige Forschung.

Zusätzlich werden in der Studienphase gesammelte Urinproben für die folgenden Auswertungen verwendet.

1. Proteomische und metabolomische Untersuchungen.
2. Speicher für zukünftige Forschung.

Die Ergebnisse der klinischen Bewertungen werden den Teilnehmern zurückgegeben.

Experimentelle Studien:

Transkriptomik: Wir werden eine RNA-Seq-Analyse an 50 Personen in jeder Gruppe durchführen, um die Transkriptom-Signatur zu untersuchen. RNA wird aus Tempus- oder PAXgene-Röhrchen extrahiert, kodiert und durch RNA-Seq analysiert. Die gewonnenen Daten werden anschließend auf RNA-Expressionsmuster und -veränderungen ausgewertet.

Proteomik: Blut- und Urin-Proteomik wird schnell zu einem wichtigen Werkzeug, um die Entdeckung, Validierung, Diagnostik und andere Bereiche von Biomarkern voranzutreiben. Wir werden Serum- und Urin-Proteomik von einer Untergruppe von Personen (n = 30) in jeder Gruppe verwenden, um Proteomik durch Flüssigkeitschromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie durchzuführen. Eine bioinformatische Analyse der Proteinexpression in diesen Gruppen würde nützliche Informationen über die Proteinsignaturen von LTBI in Hochrisikopopulationen liefern.

Metabolomik: Wir werden die nicht zielgerichtete Kapillarelektrophorese-Flugzeit-Massenspektrometrie verwenden, um die Serumstoffwechselprofile einer Untergruppe von Personen (n = 30) in jeder Gruppe zu analysieren. Die Metabolomik wird die aus der Proteomik gewonnenen Daten ergänzen.

Immunologische Assays:

1. Bestimmung der Populationshäufigkeiten zirkulierender Immunzellen durch Durchflusszytometrie Unsere unten beschriebenen standardisierten Durchflusszytometrie-Panels werden auf eine Untergruppe von Personen (n=30) in jeder Gruppe angewendet (Tabelle 1). Wir werden die Frequenzen aller wichtigen Untergruppen von Immunzellen messen: Monozyten, NK-Zellen, B-Zellen und T-Zellen, einschließlich CD56+ T-Zellen. T-Zellen werden weiter unterteilt in konventionelle T-Zellen (CD4- und CD8-exprimierende Zellen) und nicht-konventionelle T-Zellen (Mukosa-assoziierte invariante T-Zellen, NK-T-Zellen und Gamma-Delta-T-Zellen). Bei konventionellen T-Zellen erfassen wir auch den Gedächtnisphänotyp und bei CD4+-T-Zellen die Th-Untergruppen. Wir führen eine Qualitätskontrolle durch, indem wir wiederholte Durchläufe von Proben aus einer Kontrollspende durchführen, um die Probenintegrität zu validieren und die manchmal drastischen technischen Schwankungen zu kontrollieren, die bei Zytometrie-Experimenten beobachtet werden. Um die technischen Schwankungen zu minimieren, wenden wir eine zentralisierte Gating-Methode an, bei der alle Ergebnisse von derselben Person analysiert werden.
2. Definieren Sie die Immunsignaturen von PBMCs und Gedächtnis-CD4+- und CD8+-T-Zellen Zellen werden auf einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierungs-(FACS)-Aria-Zytometer aus einer Untergruppe von Personen (n=20) in jeder Gruppe sortiert. Mindestens 50.000 Zellen von PBMCs und Gedächtnis-CD4+- und -CD8+-T-Zellen werden in TRIzol LS sortiert. Unserer Erfahrung nach sind mindestens 7 % der PBMCs CD4+-Gedächtniszellen und 4 % CD8+-Gedächtniszellen. Genexpressionsprofile ganzer PBMCs und sortierter Gedächtnis-T-Zellen werden durch RNA-seq unter Verwendung der genomweiten Expressionsplattform von Illumina erhalten, die die Expressionsniveaus für >50.000 identifizierte Gene im menschlichen Genom (einschließlich nicht-proteinkodierender RNA-Spezies) liefert. Probengenerierung, Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung und Kartierung werden nach klar definierten und standardisierten Protokollen durchgeführt, wobei bei jedem wichtigen Schritt Qualitätskontrollprüfungen enthalten sind, um eine qualitativ hochwertige Datengenerierung zu gewährleisten. Für die Genexpressionsanalyse, bei der eine große Anzahl von Variablen gleichzeitig getestet wird, verwenden wir die von DESeq Benjamini Hochberg korrigierten p-angepassten Werte von <0,05, um differenziell exprimierte Gene zwischen Gruppen zu identifizieren. Wir werden eine Pathway-Analyse von Genen durchführen, die zwischen den verschiedenen Vergleichen signifikant hochreguliert sind, und die zugehörigen Genmodule untersuchen. Dazu werden wir mit dem Webtool Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) ermitteln, welche Signalwege signifikant vertreten sind. Wir planen, die Ingenuity Pathway Analysis (IPA)-Software zu verwenden, um die Richtung der überrepräsentierten Funktionen und die gemeinsamen Upstream-Regulatoren für den gegebenen Satz von Genen detaillierter zu bestimmen. Ein komplementärer Ansatz folgt einer modularen Analyse, die Cluster von Genen identifiziert, die ein ähnliches Expressionsprofil aufweisen. Insbesondere planen wir, den Algorithmus der gewichteten Gene Co-Expression Network Analysis (WGCNA) zu verwenden. Durch die gleichzeitige Überwachung der Zusammensetzung der PBMC-Immunzellen, die Bestimmung der gesamten PBMC-Genexpression und die Bestimmung des Profils der CD4+- und CD8+-Gedächtnis-T-Zellen können wir krankheitsspezifische Signaturen in PBMCs im Allgemeinen erkennen und den Beitrag von T-Zell-Untergruppen zu diesen Dysregulationen identifizieren besondere.
3. Antigen-reaktive zelluläre Immunantworten durch Durchflusszytometrie definieren Antigen-reaktive zelluläre Immunantworten werden in einer Untergruppe von Individuen (n=20) in jeder Gruppe gemessen. PBMCs werden 24 Stunden lang mit PPD und M. tuberculosis-Ganzzelllysat stimuliert und Antigen-stimulierte zelluläre Immunantworten werden untersucht. Wir planen, eine Reihe von Aktivierungsmarkern (HLA-DR, CD38, OX-40 und CD153), Zytokinen (IL-2, IFNγ, TNFα, IL-17) und zytotoxischen Markern (Perforin, Granzym B, Granzym B, Granulysin, CD107a) zu untersuchen ) auf alle wichtigen konventionellen und nicht-konventionellen T-Zell-Untergruppen und NK-Zellen.

Rückgabe von Forschungsergebnissen Aus den experimentellen Studien werden keine individuellen klinischen Ergebnisse oder medizinisch verwertbaren Zufallsbefunde erwartet. Daher werden keine Forschungsergebnisse an die Teilnehmer zurückgegeben.