Včasná detekce rakoviny de Novo u příjemců transplantace jater (DETECT)

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY Transplantace jater je komplexní chirurgický zákrok a jediná kurativní léčba pro mnoho pacientů s chronickým konečným stádiem onemocnění jater a akutním selháním jater. Krátkodobé přežití u příjemců transplantátu jater se v posledních desetiletích výrazně zlepšilo s 1letým přežitím 90 %[1]. Naproti tomu ve stejném časovém období nedošlo k žádnému zlepšení dlouhodobého přežití, pouze 61–74 % příjemců transplantovaných jater žilo 10 let po transplantaci [2, 3]. A to navzdory tomu, že střední věk v době transplantace byl 48 let. De novo rakovina po transplantaci je jednou z hlavních příčin pozdní smrti a nezávislým rizikovým faktorem mortality po transplantaci jater [3, 4].

Kumulativní incidence de novo karcinomu po transplantaci jater ve skandinávské populaci je 1 % po 1 roce, 3 % po 3 letech, 4 % po 5 letech, 9 % po 10 letech a 15 % po 20 letech [5]. Riziko de novo rakoviny u příjemců transplantátu jater je dvakrát vyšší než riziko rakoviny v běžné populaci [5, 6] a ještě vyšší u dětí a dospívajících [3]. Rakoviny se navíc objevují v pokročilejším stádiu [6]. Po transplantaci jater je nezbytná celoživotní imunosupresivní léčba, aby se zabránilo odmítnutí orgánu. Imunosuprese je považována za primární rizikový faktor pro de novo rakovinu [7–10], pravděpodobně kvůli zhoršenému sledování rakoviny [8].

I když neexistují žádné spolehlivé biomarkery odrážející stav imunitní funkce u příjemců transplantovaných jater, oportunní infekce cytomegalovirem (CMV) a Torque Teno virem (TTV) se ukázaly jako náhradní opatření pro nadměrnou imunosupresi. Na rozdíl od viru Epstein-Barrové (EBV) a lidského herpesviru 8 (HHV8) nebyly CMV a TTV přímo zapojeny do patogeneze vedoucí k rakovině, a tyto viry proto mohou sloužit jako funkční markery úrovně imunosuprese [11- 13]. Vztah mezi oportunními virovými infekcemi a nevirovými de novo rakovinami po transplantaci jater nebyl dostatečně prozkoumán.

Vzhledem k vysokému výskytu rakoviny může být screening relevantní u příjemců transplantovaných jater [14, 15]. Pozitronová emisní tomografie-počítačová tomografie (PET-CT) je metodou volby k detekci de novo karcinomů, ale tato modalita je nákladná a nese riziko falešně pozitivních výsledků [16]. Metoda celogenomové fragmentace bezbuněčné DNA umožňuje diferenciaci mezi bezbuněčnou DNA od zdravých jedinců a pacientů s rakovinou [17]. V předchozí studii byla časná detekce různých druhů rakoviny možná s vysokou přesností (plocha pod křivkou (AUC) 0,94). Navíc tkáň původu mohla být identifikována z profilů fragmentace. Tato metoda nebyla zkoumána u příjemců transplantátu jater a může být použita ke screeningu příjemců, kteří by mohli mít prospěch z dalších vyšetření, jako je PET-CT.

Závěrem lze říci, že ke snížení úmrtnosti související s rakovinou u příjemců transplantovaných jater jsou zapotřebí nové nástroje k identifikaci příjemců se zvýšeným rizikem rozvoje de novo rakoviny. Zejména jsou zapotřebí nové nástroje, které umožní včasnou diagnostiku de novo rakoviny, což umožní zamýšlený léčebný zásah. Studie má potenciál poskytnout informace k odstranění důležitých mezer v našich znalostech a ke zlepšení prognózy u příjemců transplantátu jater.

CÍLE

Celkovým cílem této studie je snížit de novo mortalitu na rakovinu u příjemců transplantátu jater. K dosažení tohoto cíle:

I. Určit prevalenci a incidenci de novo rakoviny u příjemců transplantovaných jater ve Skandinávii a vytvořit algoritmus pro identifikaci vysoce rizikových jedinců II. Zkoumejte, zda jsou oportunní virové infekce (jako náhrada za nadměrnou imunosupresi) spojeny s nevirovými de novo rakovinami III. Zkoumejte, zda lze bezbuněčnou fragmentaci DNA použít k identifikaci příjemců transplantátu jater s de novo rakovinou a k identifikaci rakoviny v asymptomatickém stadiu

METODY Tato studie je multicentrická průřezová studie případ-kontrola u příjemců transplantátu jater ve věku 20 až 100 let z pěti skandinávských center pro transplantaci jater (Kodaň, Oslo, Göteborg, Stockholm, Helsinky). Tato centra spolupracují v organizaci pro výměnu orgánů Scandiatransplant s cílem podporovat výzkum a vývoj dárcovství, alokace a transplantace orgánů. V poslední dekádě bylo v databázi Scandiatransplant registrováno 3628 příjemců transplantátu jater a všichni budou zahrnuti do studie [18, 19, 20].

Vzorky plazmy, séra a plné krve odebrané před transplantací jater a následně během následného sledování po transplantaci jater od příjemců ve Skandinávii byly uloženy ve vyhrazené biobance v Rigshospitalet (n=932). Začleňování probíhá a očekáváme, že v době navrhovaných analýz bude zahrnuto dalších 300 pacientů.

Z lokálních onkologických registrů bude registrován typ rakoviny a datum diagnózy a z databáze Scandiatransplant a elektronických záznamů budou načteny klinické proměnné. Patří mezi ně věk, pohlaví, imunosupresivní režim a délka trvání vč. hladiny takrolimu, akutní rejekce, nálezy jaterní biopsie, indikace k transplantaci jater, alkohol a kouření v anamnéze a komorbidita.

CMV & TTV Ve vnořené studii případ-kontrola mezi 67 příjemci transplantátu jater s rakovinou a 207 příjemci transplantátu jater bez rakoviny jsou vzorky krve vyšetřovány na TTV-DNA a CMV-DNA jako nezávislé rizikové faktory rakoviny po transplantaci jater. Předchozí studie ukázaly, že virová nálož TTV souvisí s intenzitou imunosuprese [11, 13], proč lze virovou nálož TTV použít jako marker imunosuprese. Ačkoli více než 80 % dospělých je CMV-seropozitivních, detekovatelná replikace CMV viru je méně častá. U CMV použijeme detekovatelnou replikaci CMV jako marker nadměrné imunosuprese [12, 21]. Detekce a kvantifikace CMV-DNA v krvi se provádí jako rutinní analýza na Oddělení klinické mikrobiologie, Rigshospitalet pod CE-IVD na platformě Roche cobas 6800 a kvalita je externě zajištěna a kalibrována podle mezinárodního standardu WHO. Pro detekci a kvantifikaci TTV-DNA se používá test Biomerieux Argene TTV R-GENE: DNA je purifikována na Qiagen Qiacube a PCR v reálném čase je prováděna na Agilent AriaMx. Měření TTV-DNA je prováděno pouze jako výzkum, protože analýza dosud nebyla zavedena jako rutinní provoz. Nikolai Kirkby je zodpovědný za provedení a zajištění kvality analýz pro CMV / TTV-DNA.

Bezbuněčná fragmentace DNA V případové kontrolní studii jsou vzorky krve z biobanky vyšetřovány s bezbuněčnou fragmentací DNA u 67 příjemců transplantátu jater s rakovinou a 207 odpovídajících kontrol. Bezbuněčná DNA v plazmě je analyzována mělkým celogenomovým sekvenováním a DELFI (vyhodnocení DNA fragmentů pro časné zachycení). DELFI je algoritmus strojového učení vyvinutý členy projektové skupiny. Používá se k detekci rakoviny a tkáně, ze které rakovina pochází, zkoumáním velikosti fragmentů a vzoru bezbuněčné DNA [17]. U příjemců, u kterých je měřen rakovinný signál, budou vzorky krve před diagnózou rakoviny analyzovány, aby se zjistilo, zda je metoda schopna detekovat rakovinu před klinickými příznaky. Bezbuněčné analýzy fragmentace DNA provádí Claus Lindberg Andersen na katedře molekulární medicíny Univerzity v Aarhusu.

STATISTIKA Stanovuje se prevalence a incidence de novo rakoviny u příjemců transplantovaných jater. K posouzení rizikových faktorů se jako závislá proměnná používá Coxova multivariační regresní analýza s časem do první de novo diagnózy rakoviny po transplantaci jater.

Pro vytvoření algoritmu odrážejícího riziko de novo rakoviny po transplantaci jater budou poměry rizik (HR) z významných proměnných v multivariační COX-regresi transformovány přirozeným logaritmem, aby bylo umožněno sčítání. Skóre bude vyjádřeno exponenciální funkcí tohoto součtu (tj. exp [ln (HR 1) + ln (HR 2) + ln (HR n)]).

Porovnáme standardní odchylky od profilů fragmentace bezbuněčné DNA mezi případy a kontrolami pomocí Wilcoxon rank sum testu.

POWER U příjemců transplantátu jater se virémie TTV tři měsíce po transplantaci jater zvyšovala se zvyšující se imunosupresí [13]. Virémie se zvýšila z 5,8 log10 kopií/ml při imunosupresi nízkou dávkou monoterapie na 7,3 log10 kopií/ml při kombinované léčbě. Při hodnotě alfa 0,05 a síle 0,90 se 67 případy a 201 kontrolami bude minimální detekovatelný rozdíl v TTV virémii 0,4 log10 kopií/ml (G*Power, verze 3.1.9.3).

V předchozí studii bylo 73 % případů rakoviny identifikováno s DELFI a signál rakoviny byl pozorován pouze u 1,9 % zdravých kontrol [17]. Pacienti s rakovinou a zdravá kontrola však nemusí být srovnatelní s příjemci transplantovaných jater s ohledem na analýzy DELFI. Vzhledem k riziku zánětu/rejekce máme podezření na vyšší riziko rakovinového signálu v kontrolní skupině. Vzhledem k hodnotě alfa 0,05 a síle 0,90 se 67 případy a 201 kontrolami bude minimální detekovatelný rozdíl v poměru 21 % (73 % u případů a 52 % u kontrol) (G*Power, verze 3.1.9.3). Střední doba od odběru krve do zmrazení pro naše vzorky plazmy je méně než 3 hodiny, což je přijatelné pro analýzy fragmentace bezbuněčné DNA.