Раннее выявление рака de Novo у реципиентов трансплантата печени (DETECT)

ПРЕДПОСЫЛКИ Трансплантация печени является сложной хирургической процедурой и единственным радикальным методом лечения многих пациентов с терминальной стадией хронического заболевания печени и острой печеночной недостаточностью. Краткосрочная выживаемость реципиентов трансплантата печени заметно улучшилась за последние десятилетия, при этом годовая выживаемость составляет 90% [1]. Напротив, за тот же период времени не было улучшения долгосрочной выживаемости: только 61–74% реципиентов печени прожили 10 лет после трансплантации [2, 3]. И это несмотря на то, что средний возраст на момент трансплантации составляет 48 лет. Рак de novo после трансплантации является одной из ведущих причин поздней смерти и независимым фактором риска смертности после трансплантации печени [3, 4].

Кумулятивная заболеваемость раком de novo после трансплантации печени в скандинавской популяции составляет 1% через 1 год, 3% через 3 года, 4% через 5 лет, 9% через 10 лет и 15% через 20 лет [5]. Риск рака de novo у реципиентов печени в два раза превышает риск рака в общей популяции [5, 6] и даже выше у детей и подростков [3]. Кроме того, рак присутствует на более поздних стадиях [6]. После трансплантации печени необходимо пожизненное иммуносупрессивное лечение для предотвращения отторжения органа. Иммуносупрессия считается основным фактором риска возникновения рака de novo [7-10], вероятно, из-за нарушения наблюдения за раком [8].

Хотя надежных биомаркеров, отражающих состояние иммунной функции у реципиентов трансплантата печени, не существует, было показано, что оппортунистические инфекции, вызванные цитомегаловирусом (ЦМВ) и вирусом Torque Teno (TTV), действуют как суррогатные меры для чрезмерной иммуносупрессии. В отличие от вируса Эпштейна-Барр (EBV) и вируса герпеса человека 8 (HHV8), CMV и TTV не были непосредственно вовлечены в патогенез, приводящий к раку, и поэтому эти вирусы могут служить функциональными маркерами уровня иммуносупрессии [11-11]. 13]. Взаимосвязь между оппортунистическими вирусными инфекциями и невирус-ассоциированным раком de novo после трансплантации печени изучена недостаточно.

Из-за высокой заболеваемости раком скрининг может быть актуальным для реципиентов трансплантата печени [14, 15]. Позитронно-эмиссионная томография-компьютерная томография (ПЭТ-КТ) является методом выбора для выявления рака de novo, но этот метод является дорогостоящим и сопряжен с риском ложноположительных результатов [16]. Метод полногеномной фрагментации бесклеточной ДНК позволяет дифференцировать бесклеточную ДНК здоровых людей и больных раком [17]. В предыдущем исследовании раннее выявление различных видов рака было возможно с высокой точностью (площадь под кривой (AUC) 0,94). Кроме того, ткань происхождения может быть идентифицирована по профилям фрагментации. Этот метод не был исследован у реципиентов трансплантата печени и может быть использован для скрининга реципиентов, которым могут быть полезны дальнейшие исследования, такие как ПЭТ-КТ.

В заключение, чтобы снизить смертность от рака у реципиентов трансплантата печени, необходимы новые инструменты для выявления реципиентов с повышенным риском развития рака de novo. В частности, необходимы новые инструменты, которые позволят диагностировать рак de novo на раннем этапе, что позволит провести лечебное вмешательство. Исследование может предоставить информацию, чтобы закрыть важные пробелы в наших знаниях и улучшить прогноз у реципиентов трансплантата печени.

ЦЕЛИ

Общая цель настоящего исследования — снизить смертность от рака de novo у реципиентов трансплантата печени. Для достижения этой цели мы:

I. Определить распространенность и заболеваемость раком de novo у реципиентов печени в Скандинавии и разработать алгоритм для выявления лиц с высоким риском II. Выяснить, связаны ли оппортунистические вирусные инфекции (как суррогат чрезмерной иммуносупрессии) с раком de novo, не связанным с вирусом III. Изучить, можно ли использовать бесклеточную фрагментацию ДНК для выявления реципиентов трансплантата печени с раком de novo, а также для выявления рака на бессимптомной стадии.

МЕТОДЫ Это исследование представляет собой многоцентровое перекрестное исследование случай-контроль реципиентов печени в возрасте от 20 до 100 лет из пяти скандинавских центров трансплантации печени (Копенгаген, Осло, Гетеборг, Стокгольм, Хельсинки). Эти центры сотрудничают в организации по обмену органами Scandiatransplant с целью продвижения исследований и развития донорства, распределения и трансплантации органов. За последнее десятилетие в базе данных Scandiatransplant зарегистрировано 3628 реципиентов печени, и все они будут включены в исследование [18, 19, 20].

Образцы плазмы, сыворотки и цельной крови, собранные до трансплантации печени и последовательно во время последующего наблюдения после трансплантации печени у реципиентов в Скандинавии, хранятся в специальном биобанке в Ригшоспиталете (n = 932). Включение продолжается, и мы ожидаем, что к моменту предлагаемого анализа мы включим еще 300 пациентов.

Из местных раковых регистров будут зарегистрированы тип рака и дата постановки диагноза, а из базы данных Scandiatransplant и электронных записей будут извлечены клинические переменные. К ним относятся возраст, пол, иммуносупрессивный режим и продолжительность в т.ч. уровни такролимуса, острое отторжение, результаты биопсии печени, показания к трансплантации печени, алкоголь и курение в анамнезе и сопутствующие заболевания.

ЦМВ и TTV В исследовании случай-контроль среди 67 реципиентов печени с раком и 207 реципиентов печени без рака образцы крови исследуются на TTV-ДНК и ЦМВ-ДНК как независимые факторы риска развития рака после трансплантации печени. Предыдущие исследования показали, что вирусная нагрузка TTV связана с выраженностью иммуносупрессии [11, 13], поэтому вирусная нагрузка TTV может использоваться в качестве маркера иммуносупрессии. Хотя более 80% взрослых являются серопозитивными по ЦМВ, обнаруживаемая репликация вируса ЦМВ встречается реже. Для ЦМВ мы будем использовать обнаруживаемую репликацию ЦМВ в качестве маркера чрезмерной иммуносупрессии [12, 21]. Обнаружение и количественное определение ЦМВ-ДНК в крови выполняется в качестве рутинного анализа в отделении клинической микробиологии Ригшоспиталета в рамках CE-IVD на платформе Roche cobas 6800, а его качество гарантируется внешним контролем и откалибровано в соответствии с международным стандартом ВОЗ. Для обнаружения и количественного определения TTV-ДНК используется анализ Biomerieux Argene TTV R-GENE: ДНК очищается на Qiagen Qiacube, а ПЦР в реальном времени выполняется на Agilent AriaMx. Измерение TTV-ДНК проводится только в качестве исследования, поскольку анализ еще не стал рутинной операцией. Николай Киркби отвечает за выполнение и обеспечение качества анализов на ЦМВ/ТТВ-ДНК.

Фрагментация внеклеточной ДНК В исследовании случай-контроль образцы крови из биобанка исследуются на фрагментацию бесклеточной ДНК среди 67 реципиентов печени, больных раком, и 207 человек из контрольной группы. Внеклеточную ДНК в плазме анализируют с помощью неглубокого полногеномного секвенирования и DELFI (оценка фрагментов ДНК для раннего перехвата). DELFI — это алгоритм машинного обучения, разработанный участниками проектной группы. Он используется для обнаружения рака и ткани, из которой возникает рак, путем изучения размера фрагмента и структуры внеклеточной ДНК [17]. У реципиентов, у которых измеряется раковый сигнал, образцы крови перед диагностикой рака будут проанализированы, чтобы выяснить, способен ли метод обнаружить рак до появления клинических симптомов. Анализ фрагментации бесклеточной ДНК проводится на кафедре молекулярной медицины Орхусского университета Клаусом Линдбергом Андерсеном.

СТАТИСТИКА Определены распространенность и заболеваемость раком de novo у реципиентов трансплантата печени. Для оценки факторов риска применяется многомерный регрессионный анализ Кокса, в котором в качестве зависимой переменной используется время до первого диагноза рака de novo после трансплантации печени.

Чтобы создать алгоритм, отражающий риск развития рака de novo после трансплантации печени, отношения рисков (HR) от значимых переменных в многомерной регрессии ЦОГ будут преобразованы с использованием натуральных логарифмов, чтобы можно было складывать. Оценка будет выражена экспоненциальной функцией этого суммирования (т.е. exp [ln (HR 1) + ln (HR 2) + ln (HR n)]).

Мы сравним стандартные отклонения от профилей фрагментации бесклеточной ДНК между случаями и контролем с помощью критерия суммы рангов Уилкоксона.

СИЛА У реципиентов трансплантата печени виремия TTV через три месяца после трансплантации печени увеличивалась с усилением иммуносупрессии [13]. Виремия увеличилась с 5,8 log10 копий/мл при монотерапии низкими дозами иммуносупрессии до 7,3 log10 копий/мл при комбинированном лечении. При альфа 0,05 и мощности 0,90 с 67 случаями и 201 контрольной минимальной определяемой разницей в виремии TTV будет 0,4 log10 копий/мл (G*Power, версия 3.1.9.3).

В предыдущем исследовании 73% случаев рака были идентифицированы с помощью DELFI, а сигнал рака был виден только у 1,9% здоровых людей [17]. Тем не менее, больные раком и здоровые люди могут быть несопоставимы с реципиентами трансплантата печени в отношении анализа DELFI. Из-за риска воспаления/отторжения мы подозреваем более высокий риск сигнала рака в контрольной группе. Учитывая альфа 0,05 и мощность 0,90 с 67 случаями и 201 контролем, минимальная обнаруживаемая разница в пропорции составит 21% (73% в случаях и 52% в контроле) (G*Power, версия 3.1.9.3). Среднее время от забора крови до замораживания для наших образцов плазмы составляет менее 3 часов, что приемлемо для анализа фрагментации бесклеточной ДНК.