Tidlig påvisning av de Novo-kreft hos levertransplantasjonsmottakere (DETECT)

BAKGRUNN Levertransplantasjon er en kompleks kirurgisk prosedyre og den eneste kurative behandlingen for mange pasienter med kronisk leversykdom i sluttstadiet og akutt leversvikt. Korttidsoverlevelsen for levertransplanterte har forbedret seg markant de siste tiårene med en 1-års overlevelse på 90 %[1]. I motsetning til dette har det ikke vært noen forbedring i langtidsoverlevelsen i samme tidsperiode, med bare 61-74 % av levertransplanterte som lever 10 år etter transplantasjon [2, 3]. Dette til tross for at medianalderen ved transplantasjonstidspunktet er 48 år. De novo kreft etter transplantasjon er en av de viktigste årsakene til sen død og en uavhengig risikofaktor for dødelighet etter levertransplantasjon [3, 4].

Den kumulative forekomsten av de novo-kreft etter levertransplantasjon i den skandinaviske befolkningen er 1 % ved 1 år, 3 % ved 3 år, 4 % ved 5 år, 9 % ved 10 år, og 15 % ved 20 år [5]. Risikoen for de novo kreft for levertransplanterte er dobbelt så stor som kreftrisikoen i befolkningen generelt [5, 6] og enda høyere for barn og ungdom [3]. I tillegg kommer kreft på et mer avansert stadium [6]. Etter levertransplantasjon er livslang immunsuppressiv behandling nødvendig for å forhindre organavstøtning. Immunsuppresjon anses som en primær risikofaktor for de novo kreft [7-10], sannsynligvis på grunn av nedsatt kreftovervåking [8].

Selv om det ikke er noen pålitelige biomarkører som gjenspeiler statusen til immunfunksjonen hos levertransplanterte, har opportunistiske infeksjoner med Cytomegalovirus (CMV) og Torque Teno Virus (TTV) vist seg å fungere som surrogattiltak for overimmunsuppresjon. I motsetning til Epstein-Barr-virus (EBV) og humant herpesvirus 8 (HHV8), har ikke CMV og TTV vært direkte implisert i patogenesen som fører til kreft, og disse virusene kan derfor tjene som funksjonelle markører for nivået av immunsuppresjon [11- 1. 3]. Forholdet mellom opportunistiske virusinfeksjoner og ikke-virusassosierte de novo kreftformer etter levertransplantasjon er ikke tilstrekkelig undersøkt.

På grunn av høy forekomst av kreft kan screening være aktuelt hos levertransplanterte [14, 15]. Positron Emission Tomography-Computed Tomography (PET-CT) er den foretrukne metoden for å oppdage de novo kreftformer, men modaliteten er kostbar og medfører risiko for falske positive resultater [16]. Metoden genomomfattende cellefri DNA-fragmentering tillater differensiering mellom cellefritt DNA fra friske individer og pasienter med kreft [17]. I en tidligere studie var tidlig påvisning av ulike kreftformer mulig med høy nøyaktighet (areal under kurve (AUC) på 0,94). Dessuten kunne opprinnelsesvev identifiseres fra fragmenteringsprofiler. Denne metoden har ikke blitt undersøkt hos levertransplanterte og kan brukes til å screene mottakere, som kan ha nytte av ytterligere undersøkelser som PET-CT.

Som konklusjon, for å redusere kreftrelatert dødelighet hos levertransplanterte, er det nødvendig med nye verktøy for å identifisere mottakere med økt risiko for å utvikle de novo-kreft. Spesielt er det behov for nye verktøy som vil tillate diagnostisering av de novo kreft på et tidlig tidspunkt som tillater kurativ tiltenkt intervensjon. Studien har potensial til å gi informasjon for å lukke viktige hull i vår kunnskap og for å forbedre prognosen hos levertransplanterte.

MÅL

De overordnede målene med denne studien er å redusere de novo kreftdødelighet hos levertransplanterte. For å oppnå dette målet vil vi:

I. Bestem prevalens og forekomst av de novo-kreft hos levertransplanterte i Skandinavia og bygg en algoritme for å identifisere høyrisikoindivider II. Undersøk om opportunistiske virusinfeksjoner (som et surrogat for overimmunsuppresjon) er assosiert med ikke-virusassosierte de novo kreftformer III. Undersøk om cellefri DNA-fragmentering kan brukes til å identifisere levertransplanterte mottakere med de novo-kreft, og for å identifisere kreft i et asymptomatisk stadium

METODER Denne studien er en multisenter tverrsnitts-case-kontrollstudie i levertransplanterte, i alderen mellom 20 og 100 år, fra fem skandinaviske levertransplantasjonssentre (København, Oslo, Gøteborg, Stockholm, Helsingfors). Disse sentrene samarbeider i organutvekslingsorganisasjonen Scandiatransplant med mål om å fremme forskning og utvikle organdonasjon, allokering og transplantasjon. Det siste tiåret har 3628 levertransplanterte blitt registrert i Scandiatransplant-databasen, og alle vil bli inkludert i studien [18, 19, 20].

Plasma-, serum- og fullblodsprøver, tatt før levertransplantasjon og sekvensielt under post-levertransplantasjonsoppfølging, fra mottakere i Skandinavia har blitt lagret i en dedikert biobank på Rigshospitalet (n=932). Inkludering pågår og vi forventer å ha inkludert ytterligere 300 pasienter på tidspunktet for de foreslåtte analysene.

Fra lokale kreftregistre vil krefttype og diagnostiseringsdato bli registrert, og fra Scandiatransplant-databasen og elektroniske journaler vil kliniske variabler bli hentet ut. Disse inkluderer alder, kjønn, immunsuppressivt regime og varighet inkl. takrolimusnivåer, akutte avstøtninger, leverbiopsifunn, indikasjon for levertransplantasjon, alkohol- og røykehistorie og komorbiditet.

CMV & TTV I en nestet case-control studie blant 67 levertransplanterte med kreft og 207 levertransplanterte uten kreft, undersøkes blodprøver for TTV-DNA og CMV-DNA som uavhengige risikofaktorer for kreft etter levertransplantasjon. Tidligere studier har vist at TTV viral belastning er assosiert med intensiteten av immunsuppresjon [11, 13], hvorfor TTV viral load kan brukes som en markør for immunsuppresjon. Selv om mer enn 80 % av voksne er CMV-seropositive, er påvisbar CMV-virusreplikasjon mindre vanlig. For CMV vil vi bruke påvisbar CMV-replikasjon som en markør for overimmunsuppresjon [12, 21]. Påvisning og kvantifisering av CMV-DNA i blod utføres som en rutineanalyse ved Avdeling for klinisk mikrobiologi, Rigshospitalet under CE-IVD på Roche cobas 6800-plattformen og er kvalitetssikret eksternt og kalibrert etter WHOs internasjonale standard. For påvisning og kvantifisering av TTV-DNA brukes Biomerieux Argene TTV R-GENE-analysen: DNA renses på Qiagen Qiacube og sanntids-PCR utføres på Agilent AriaMx. Måling av TTV-DNA utføres kun som forskning, da analysen ennå ikke er etablert som rutineoperasjon. Nikolai Kirkby er ansvarlig for gjennomføring og kvalitetssikring av analysene for CMV / TTV-DNA.

Cellefri DNA-fragmentering I en case-control studie undersøkes blodprøver fra biobanken med cellefri DNA-fragmentering blant 67 levertransplanterte pasienter med kreft og 207 matchede kontroller. Cellefritt DNA i plasma analyseres ved grunne helgenomsekvensering og DELFI (DNA-evaluering av fragmenter for tidlig avlytting). DELFI er en maskinlæringsalgoritme utviklet av medlemmer av prosjektgruppen. Den brukes til å oppdage kreft og vevet kreften stammer fra ved å undersøke fragmentstørrelse og mønster av cellefritt DNA [17]. Hos mottakere hvor det måles kreftsignal, vil blodprøver før kreftdiagnosen bli analysert for å undersøke om metoden er i stand til å oppdage kreft før kliniske symptomer. Cellefrie DNA-fragmenteringsanalyser utføres ved Institutt for molekylær medisin, Universitetet i Aarhus av Claus Lindberg Andersen.

STATISTIKK Prevalens og forekomst av de novo-kreft hos levertransplanterte blir bestemt. For å vurdere risikofaktorer, brukes Cox multivariat regresjonsanalyse med tiden til første de novo kreftdiagnose etter levertransplantasjon som en avhengig variabel.

For å etablere en algoritme som reflekterer risikoen for de novo kreft etter levertransplantasjon, vil hazard ratio (HR) fra signifikante variabler i den multivariate COX-regresjonen transformeres med naturlig logaritme for å muliggjøre addisjon. Poengsummen vil bli uttrykt av den eksponentielle funksjonen til denne summeringen (dvs. exp [ln (HR 1) + ln (HR 2) + ln (HR n)]).

Vi vil sammenligne standardavvikene fra cellefrie DNA-fragmenteringsprofiler mellom tilfeller og kontroller ved hjelp av en Wilcoxon rangsumtest.

POWER Hos levertransplanterte økte TTV-viremi tre måneder etter levertransplantasjon med økende immunsuppresjon [13]. Viremi økte fra 5,8 log10 kopier/ml ved lavdose monoterapi-immunsuppresjon til 7,3 log10 kopier/ml i kombinasjonsbehandling. Gitt en alfa på 0,05 og en styrke på 0,90 med 67 tilfeller og 201 kontroll, vil den minimale påvisbare forskjellen i TTV-viremi være 0,4 log10 kopier/ml (G*Power, versjon 3.1.9.3).

I en tidligere studie ble 73 % av krefttilfellene identifisert med DELFI og kreftsignal ble bare sett hos 1,9 % av friske kontrollpersoner [17]. Imidlertid kan det hende at kreftpasienter og sunn kontroll ikke kan sammenlignes med levertransplanterte med hensyn til DELFI-analyser. På grunn av risiko for betennelse/avstøtning mistenker vi høyere risiko for kreftsignal i kontrollgruppen. Gitt en alfa på 0,05 og en styrke på 0,90 med 67 tilfeller og 201 kontroller, vil den minimale detekterbare forskjellen i andel være 21 % (73 % i tilfeller og 52 % i kontroller) (G*Power, versjon 3.1.9.3). Mediantiden fra blodprøvetaking til frysing for våre plasmaprøver er mindre enn 3 timer, noe som er akseptabelt for cellefri DNA-fragmenteringsanalyser.