Wczesne wykrywanie raka de novo u biorców przeszczepów wątroby (DETECT)

Tło Przeszczep wątroby jest złożoną procedurą chirurgiczną i jedynym sposobem leczenia wielu pacjentów z przewlekłą schyłkową chorobą wątroby i ostrą niewydolnością wątroby. Krótkoterminowe przeżycie biorców przeszczepu wątroby znacznie się poprawiło w ostatnich dziesięcioleciach, osiągając roczne przeżycie na poziomie 90% [1]. W przeciwieństwie do tego, w tym samym okresie nie nastąpiła poprawa długoterminowego przeżycia, tylko 61-74% biorców przeszczepu wątroby przeżyło 10 lat po przeszczepie [2, 3]. Dzieje się tak pomimo mediany wieku w chwili przeszczepu wynoszącej 48 lat. Rak de novo po transplantacji jest jedną z głównych przyczyn późnej śmierci i niezależnym czynnikiem ryzyka zgonu po transplantacji wątroby [3, 4].

Skumulowana częstość występowania raka de novo po przeszczepieniu wątroby w populacji skandynawskiej wynosi 1% po roku, 3% po 3 latach, 4% po 5 latach, 9% po 10 latach i 15% po 20 latach [5]. Ryzyko zachorowania na raka de novo u biorców przeszczepu wątroby jest dwukrotnie większe niż w populacji ogólnej [5, 6], a nawet wyższe u dzieci i młodzieży [3]. Ponadto nowotwory występują w bardziej zaawansowanym stadium [6]. Po przeszczepieniu wątroby konieczne jest dożywotnie leczenie immunosupresyjne, aby zapobiec odrzuceniu narządu. Immunosupresja jest uważana za główny czynnik ryzyka raka de novo [7-10], prawdopodobnie z powodu upośledzonego nadzoru nad nowotworem [8].

Chociaż nie ma wiarygodnych biomarkerów odzwierciedlających stan funkcji odpornościowej u biorców przeszczepu wątroby, wykazano, że oportunistyczne infekcje wirusem cytomegalii (CMV) i wirusem Torque Teno (TTV) działają jako środki zastępcze w przypadku nadmiernej immunosupresji. W przeciwieństwie do wirusa Epsteina-Barra (EBV) i ludzkiego wirusa opryszczki 8 (HHV8), CMV i TTV nie są bezpośrednio zaangażowane w patogenezę prowadzącą do raka, a zatem wirusy te mogą służyć jako funkcjonalne markery poziomu immunosupresji [11- 13]. Związek między zakażeniami wirusami oportunistycznymi a nowotworami niezwiązanymi z wirusami de novo po przeszczepieniu wątroby nie został wystarczająco zbadany.

Ze względu na dużą zachorowalność na raka, badania przesiewowe mogą być istotne u biorców przeszczepu wątroby [14, 15]. Metodą z wyboru w wykrywaniu nowotworów de novo jest pozytronowa tomografia emisyjna-tomografia komputerowa (PET-CT), ale metoda ta jest kosztowna i niesie ze sobą ryzyko wyników fałszywie dodatnich [16]. Metoda ogólnokomórkowej fragmentacji wolnego DNA pozwala na rozróżnienie między wolnym od komórek DNA osób zdrowych i pacjentów z chorobą nowotworową [17]. W poprzednim badaniu możliwe było wczesne wykrycie różnych nowotworów z dużą dokładnością (pole pod krzywą (AUC) 0,94). Ponadto tkankę pochodzenia można było zidentyfikować na podstawie profili fragmentacji. Ta metoda nie była badana u biorców przeszczepu wątroby i może być stosowana do badań przesiewowych biorców, którzy mogliby odnieść korzyści z dalszych badań, takich jak PET-CT.

Podsumowując, aby zmniejszyć śmiertelność związaną z rakiem u biorców przeszczepu wątroby, potrzebne są nowe narzędzia do identyfikacji biorców ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka de novo. W szczególności potrzebne są nowe narzędzia, które umożliwią diagnozę raka de novo we wczesnym punkcie czasowym, który umożliwi zamierzoną interwencję leczniczą. Badanie może dostarczyć informacji pozwalających wypełnić ważne luki w naszej wiedzy i poprawić rokowanie u biorców przeszczepu wątroby.

CELE

Ogólnym celem niniejszego badania jest zmniejszenie śmiertelności z powodu raka de novo u biorców przeszczepu wątroby. Aby osiągnąć ten cel, będziemy:

I. Określenie rozpowszechnienia i zachorowalności na raka de novo u biorców przeszczepów wątroby w Skandynawii oraz zbudowanie algorytmu identyfikacji osób wysokiego ryzyka II. Zbadaj, czy oportunistyczne infekcje wirusowe (jako substytut nadmiernej immunosupresji) są związane z niezwiązanymi z wirusami nowotworami de novo III. Zbadanie, czy fragmentacja DNA bez komórek może być wykorzystana do identyfikacji biorców przeszczepów wątroby z rakiem de novo oraz do identyfikacji raka na etapie bezobjawowym

METODY Niniejsze badanie jest wieloośrodkowym przekrojowym badaniem kliniczno-kontrolnym u biorców przeszczepu wątroby w wieku od 20 do 100 lat z pięciu skandynawskich ośrodków przeszczepiania wątroby (Kopenhaga, Oslo, Göteborg, Sztokholm, Helsinki). Ośrodki te współpracują w ramach organizacji wymiany narządów Scandiatransplant w celu promowania badań i rozwoju dawstwa, alokacji i przeszczepiania narządów. W ciągu ostatniej dekady w bazie danych Scandiatransplant zarejestrowano 3628 biorców przeszczepu wątroby i wszyscy zostaną włączeni do badania [18, 19, 20].

Próbki osocza, surowicy i krwi pełnej, pobrane przed przeszczepem wątroby i sekwencyjnie podczas obserwacji po przeszczepie wątroby, od biorców w Skandynawii były przechowywane w dedykowanym biobanku w Rigshospitalet (n=932). Włączenie jest w toku i spodziewamy się, że w czasie proponowanych analiz włączymy dodatkowo 300 pacjentów.

Z lokalnych rejestrów nowotworów rejestrowany będzie typ nowotworu i data rozpoznania, az bazy danych Scandiatransplant i zapisów elektronicznych pobierane będą zmienne kliniczne. Obejmują one wiek, płeć, reżim immunosupresyjny i czas trwania, w tym. poziom takrolimusu, ostre odrzucanie przeszczepu, wyniki biopsji wątroby, wskazania do przeszczepu wątroby, wywiad dotyczący alkoholu i palenia tytoniu oraz choroby współistniejące.

CMV i TTV W zagnieżdżonym badaniu kliniczno-kontrolnym pośród 67 biorców przeszczepu wątroby z rakiem i 207 biorców przeszczepu wątroby bez raka, próbki krwi są badane pod kątem TTV-DNA i CMV-DNA jako niezależnych czynników ryzyka raka po przeszczepie wątroby. Wcześniejsze badania wykazały, że miano wirusa TTV jest związane z intensywnością immunosupresji [11, 13], dlatego miano wirusa TTV może być stosowane jako marker immunosupresji. Chociaż ponad 80% dorosłych jest seropozytywnych w kierunku CMV, wykrywalna replikacja wirusa CMV jest mniej powszechna. W przypadku CMV użyjemy wykrywalnej replikacji CMV jako markera nadmiernej immunosupresji [12, 21]. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe CMV-DNA we krwi przeprowadzane jest jako rutynowa analiza w Departamencie Mikrobiologii Klinicznej Rigshospitalet w ramach CE-IVD na platformie Roche cobas 6800, a jakość jest zapewniana z zewnątrz i kalibrowana zgodnie z międzynarodowym standardem WHO. Do wykrywania i oznaczania ilościowego TTV-DNA stosuje się test Biomerieux Argene TTV R-GENE: DNA oczyszcza się na Qiagen Qiacube i przeprowadza się reakcję PCR w czasie rzeczywistym na Agilent AriaMx. Pomiar TTV-DNA jest wykonywany wyłącznie w celach badawczych, ponieważ analiza nie została jeszcze uznana za rutynową operację. Nikolai Kirkby jest odpowiedzialny za wykonanie i zapewnienie jakości analiz w kierunku CMV / TTV-DNA.

Fragmentacja DNA bez komórek W badaniu kliniczno-kontrolnym próbki krwi z biobanku są badane pod kątem fragmentacji DNA bez komórek wśród 67 biorców przeszczepów wątroby z rakiem i 207 dopasowanych kontroli. Wolne od komórek DNA w osoczu jest analizowane za pomocą płytkiego sekwencjonowania całego genomu i DELFI (ocena DNA fragmentów pod kątem wczesnego przechwycenia). DELFI to algorytm uczenia maszynowego opracowany przez członków grupy projektowej. Służy do wykrywania raka i tkanki, z której pochodzi rak, poprzez badanie wielkości fragmentów i wzoru pozakomórkowego DNA [17]. U biorców, u których mierzony jest sygnał raka, próbki krwi przed zdiagnozowaniem raka zostaną przeanalizowane w celu zbadania, czy metoda jest w stanie wykryć raka przed wystąpieniem objawów klinicznych. Analizy fragmentacji DNA bez komórek są wykonywane na Wydziale Medycyny Molekularnej Uniwersytetu w Aarhus przez Clausa Lindberga Andersena.

STATYSTYKA Określa częstość występowania i częstość występowania raka de novo u biorców przeszczepu wątroby. Aby ocenić czynniki ryzyka, stosuje się wieloczynnikową analizę regresji Coxa z czasem do pierwszego rozpoznania raka de novo po przeszczepieniu wątroby jako zmienną zależną.

Aby ustalić algorytm odzwierciedlający ryzyko raka de novo po przeszczepie wątroby, współczynniki ryzyka (HR) z istotnych zmiennych w wieloczynnikowej regresji COX zostaną przekształcone za pomocą logarytmu naturalnego, aby umożliwić dodawanie. Wynik zostanie wyrażony przez funkcję wykładniczą tego sumowania (tj. exp [ln (HR 1) + ln (HR 2) + ln (HR n)]).

Porównamy odchylenia standardowe profili fragmentacji DNA bez komórek między przypadkami i kontrolami za pomocą testu sumy rang Wilcoxona.

POWER U biorców przeszczepu wątroby wiremia TTV po trzech miesiącach od przeszczepu wątroby wzrastała wraz ze wzrostem immunosupresji [13]. Wiremia wzrosła z 5,8 log10 kopii/ml w przypadku immunosupresji małymi dawkami w monoterapii do 7,3 log10 kopii/ml w leczeniu skojarzonym. Biorąc pod uwagę alfa 0,05 i moc 0,90 przy 67 przypadkach i 201 kontroli, minimalna wykrywalna różnica w wiremii TTV wyniesie 0,4 log10 kopii/ml (G*Power, wersja 3.1.9.3).

W poprzednim badaniu za pomocą DELFI zidentyfikowano 73% przypadków raka, a sygnał raka zaobserwowano tylko u 1,9% zdrowych osób z grupy kontrolnej [17]. Jednak pacjenci z rakiem i zdrowa grupa kontrolna mogą nie być porównywalni z biorcami przeszczepu wątroby w odniesieniu do analiz DELFI. Ze względu na ryzyko zapalenia/odrzutu podejrzewamy większe ryzyko sygnału nowotworowego w grupie kontrolnej. Biorąc pod uwagę alfa 0,05 i moc 0,90 z 67 przypadkami i 201 kontrolami, minimalna wykrywalna różnica proporcji wyniesie 21% (73% w przypadkach i 52% w kontrolach) (G*Power, wersja 3.1.9.3). Mediana czasu od pobrania krwi do zamrożenia naszych próbek osocza wynosi mniej niż 3 godziny, co jest dopuszczalne w przypadku analiz fragmentacji DNA bez komórek.