Biomarkery metabolické obezity.

Hlavní cíle práce:

1. Analýza koncentrace vybraných prozánětlivých parametrů v krevním séru a slinách osob s rozdílnou distribucí podkožní a viscerální tukové tkáně.
2. Analýza biomarkerů metabolické obezity ve slinách a krevním séru.
3. Hodnocení nových diagnostických metod pro včasné stanovení rizika metabolické obezity a jejích komplikací.

Protokol studie byl schválen Bioetickou komisí Lékařské univerzity, č.j. R-I-002/647/2019 a APK.002.39.2021. Všichni účastníci dali informovaný písemný souhlas s účastí ve studii před jejím zahájením. Studie začala v lednu 2020 a skončila v květnu 2022.

Výzkum byl prováděn na Katedře dietetiky a klinické výživy (Fakulta zdravotnických věd Lékařské univerzity v Bialystoku), oddělení biochemické diagnostiky (Univerzitní klinická nemocnice v Bialystoku) a dále na Ústavu biotechnologie (Farmaceutická fakulta s Divize laboratorní medicíny Lékařské univerzity v Bialystoku).

První návštěva se uskutečnila na katedře dietetiky a klinické výživy Lékařské univerzity v Bialystoku. Zahrnovala kvalifikaci pro studii na základě kritérií pro zařazení a vyloučení, diskusi o účelu studie a podepsání písemného souhlasu se studií účastníky, jakož i informace o ochraně jejich osobních údajů a plné anonymitě. Do studie se dobrovolně přihlásilo 200 lidí. Na základě kritérií pro zařazení a vyloučení byla provedena observační studie mezi 119 lidmi (79 žen a 41 mužů). Každý účastník obdržel individuální kód (např. A01, A02, B01, B02 atd.), která byla použita k identifikaci účastníků v dalších fázích studie.

Všichni účastníci dokončili: Průzkum kvality života Světové zdravotnické organizace (WHOQOL-BREF), Mezinárodní dotazník fyzické aktivity - IPAQ, Dotazník přesvědčení a stravovacích návyků vytvořený týmem Behavioral Conditions of Nutrition Team, Committee of Human Nutrition Science, Polská akademie věd a 3denní nutriční deník (účastníci popsali jídla zkonzumovaná po následující tři dny, včetně dvou pracovních dnů a jednoho dne volna).

Účastníci studie si nechali změřit antropometrické parametry (tělesná hmotnost, výška, obvod pasu a boků) a vypočítal se BMI (Body Mass Index). Na jejím základě byli účastníci rozděleni do studijní a kontrolní skupiny. Kromě toho byly vypočteny poměr WHR (poměr pasu k bokům), poměr WHtR (poměr pasu k výšce) a poměr RFM (relativní hmotnost tuku).

Aby bylo možné určit složení těla účastníků studie, byla provedena elektrická bioimpedanční analýza složení těla pomocí zařízení: BioScan 920-2 (Velká Británie, Essex) a InBody 270 (Jižní Korea, Soul). Vyšetření bylo provedeno ráno nalačno, bez jakékoli intenzivní fyzické námahy.

Ve studii byl také použit test kotník-pažního indexu (MESI, Krakov, Polsko) srovnávající krevní tlak naměřený v kotníku s krevním tlakem naměřeným na paži. Tato analýza byla provedena za účelem posouzení rizika aterosklerózy dolních končetin. Navíc byl všem účastníkům studie měřen krevní tlak a klidová srdeční frekvence pomocí elektrického tlakoměru.

Druhá návštěva proběhla na oddělení biochemické diagnostiky (Univerzitní klinická nemocnice v Bialystoku). Všem účastníkům studie bylo odebráno 10 ml žilní krve. Byl proveden orální glukózový toleranční test (OGTT), na jehož základě byla stanovena koncentrace glukózy a inzulinu (nalačno a po 60 a 120 minutách testu). Koncentrace celkového cholesterolu, LDL cholesterolu, HDL cholesterolu, triglyceridů, C-reaktivního proteinu, glukózy, inzulínu, sérové ​​močoviny, sérového kreatininu, sérové ​​kyseliny močové, alaninaminotransferázy (ALT) a aspartátaminotransferázy (AST) byly hodnoceny na ALINITY ci, Abbott .

Pacientům byly odebrány vzorky krve a zmraženy na -80 °C. Sérové ​​hladiny celkového adiponektinu (Quantikine ELISA Human Total Adiponectin/Acrp30 Immunoassay, R&D Systems, Abingdon, Spojené království), rezistinu (Quantikine ELISA Human Resistin Immunoassay, R&D Systems, Abingdon, Spojené království), IL-6 (ELISA QuantikineaymuILno , R&D Systems, Abingdon, UK), TNFα (Quantikine ELISA Human TNFα Immunoassay, R&D Systems, Abingdon, UK), IL-1β (Quantikine ELISA Human IL-1β/IL-1F2 Immunoassay, R&D Systems, Abingdon, UK) -23 (Quantikine ELISA Human IL-23 Immunoassay, R&D Systems, Abingdon, UK), MMP-9 (Quantikine ELISA Human MMP-9 Immunoassay, R&D Systems, Abingdon, UK) a celkový MMP-2 (Quantikine ELISA Total MMP-2 Immunoassay, R&D Systems, Abingdon, UK) byly hodnoceny pomocí ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) podle pokynů výrobce.

Třetí návštěva se uskutečnila na Ústavu biotechnologie (Farmaceutická fakulta s oddělením laboratorní medicíny Lékařské univerzity v Bialystoku).

Sliny byly odebrány standardním způsobem. Vzorky od subjektů byly odebírány mezi 9:00 a 11:00. Všechny subjekty se zdržely jídla a pití po dobu 2 hodin. Subjekty si vypláchly ústa deionizovanou vodou a seděly v pohodlné poloze s otevřenýma očima a hlavou nakloněnou mírně dopředu. Nestimulované celé sliny byly sbírány po dobu 10 minut pliváním popsaným Navazeshem. Vzorky slin byly homogenizovány a vyčeřeny centrifugací při 1200 RPMI po dobu 15 minut při 4 °C. Alikvoty vyčeřených supernatantů byly skladovány při -70 °C pro měření ELISA.

Vysoce citlivé testovací soupravy (R&D Systems, Minneapolis, USA) byly použity ke stanovení koncentrací IL-6, IL-1β, IL-23, rezistinu, MMP-9, MMP-2 a TNF-α ve vzorcích slin z účastníci studie. Testy byly provedeny podle protokolů výrobce. Mikrotitrační destička poskytnutá v soupravách byla předem potažena monoklonální protilátkou specifickou pro analyzovaný protein. Standardy a vzorky byly přidány do příslušných jamek mikrotitrační destičky. Po inkubaci při teplotě místnosti byla přidána polyklonální protilátka spojená s enzymem. Poté byly jamky mikrodestičky odsáty a čtyřikrát promyty. Dále byl do každé jamky přidán roztok substrátu. Reakce enzym-substrát byla ukončena přidáním zastavovacího roztoku a změna barvy byla měřena spektrofotometricky při 450 nm ± 2 nm. Koncentrace antigenu ve vzorcích byla stanovena porovnáním O.D. na standardní křivku. Koncentrace antigenu ve vzorcích byla stanovena porovnáním O.D. na standardní křivku.