Chemometry ke stanovení environmentálního a lidského exposomu směsí znečišťujících látek (EXPOSO-METER)

Stanovení velikosti vzorku

Výzkumný projekt EXPOSO-METER si neklade za cíl rozsáhlou kohortovou studii, ale pilotní studii proof-of-concept, která bude tvořit základ pro budoucí práci. Proto byly použity dva přístupy k určení velikosti vzorku:

1. Na základě literárního přehledu podobných studií byl identifikován úzce odpovídající příklad z časopisu na vysoké úrovni. Pracovalo celkem se 16 jedinci ze dvou německých měst (různé tkáně, celkem 88 vzorků). Práce v EXPOSO-METER tento počet účastníků studie daleko překročí. Kromě toho se očekává, že tři globální regiony budou vykazovat explicitní velké rozdíly v důsledku odlišného životního stylu a podmínek expozice v USA, Evropě a Jižní Koreji.
2. Pro výpočet velikosti vzorku byl použit Cochranův vzorec [n= (Z^2 p(1-p))/e^2]: s 90procentní hladinou spolehlivosti (Z=1,645), maximální variabilita (50 procent, tj. p=0,5) a +/-10procentní přesnost (e=0,1), poskytuje minimální velikost vzorku 68 účastníků.

V souhrnu je tedy minimální velikost vzorku 50 účastníků studie na region, přičemž ideální je 100 účastníků studie na region.

Kolekce vzorků

Cílová skupina účastníků studie je následující: 25 žen a 25 mužů ve věku 30–40 let a 5 žen a 5 účastníků z každé z těchto věkových skupin: 20–30, 40–50, 50–60, 60–70 , 70-80 let. Odebírají se následující vzorky: (1) 2-20 g vyříznutého subkutánního lipidu z podbřišku, umístí se do skleněné lahvičky označené jedinečným identifikačním číslem vzorku (ID) a skladuje se při -20 °C; (2) 5 ml krve za použití zkumavky naplněné komplexačním činidlem kyselinou ethylendiamintetraoctovou (EDTA) a označené ID a skladované při -20 °C. Kromě toho jsou účastníci studie požádáni, aby vyplnili dotazník účastníků, aby byli označeni ID. Po dokončení je sada vzorků odeslána do laboratoří UFZ.

Zpracování vzorků na UFZ

Lipidová tkáň: Vzorky budou rozmraženy, homogenizovány a stanoven obsah lipidů v nich. (a) Pasivní rovnovážné vzorkování: Ke vzorku se přidají silikonové tenkovrstvé vzorkovače, což jsou silikonové fólie vhodné velikosti a tloušťky pro lékařské účely, předem vyčištěné pomocí Soxhletovy extrakce ethylacetátem. Po cca. 48 h (potřebné pro ekvilibraci) se silikon odstraní, jeho povrch se důkladně očistí a chemikálie ze silikonu se extrahují ethylacetátem. (b) Celková extrakce: Dílčí vzorek lipidové tkáně bude extrahován přímo různými směsmi rozpouštědel. Rozpouštědlo z obou přístupů se odpaří, vzorky se čistí pomocí řady kolon a chemikálie se analyzují plynovou/kapalinovou chromatografií (GC/LC) spojenou s hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením (HRMS) nebo tandemovou hmotnostní spektrometrií (MS/). SLEČNA). Celkem bude pomocí těchto dvou technik prověřeno 150 + 400 chemikálií. Pro zajištění kvality/kontrolu kvality se používají stabilní sloučeniny vnitřního standardu značené izotopy. Výsledky budou zasazeny do kontextu napříč regiony a data z dotazníků budou použita k podpoře interpretace dat.

Krev: Vzorky krve budou podrobeny extrakčnímu postupu, který je v současné době ve vývoji, podobný přístupům popsaným výše, extrakty se čistí, koncentrují a analyzují pomocí GC/LC-HRMS (nebo MS/MS), jak je popsáno výše.

Možná rozšíření

Jako první možnost dalšího rozšíření této práce se výzkumníci zaměřují na prozkoumání necíleného screeningu širokých směsí chemikálií, které jsou kvantifikovány v cíleném režimu na UFZ. Pravděpodobně existuje mnohem více chemikálií, dosud neidentifikovaných, které by bylo zajímavé studovat, buď na UFZ, prostřednictvím spolupráce EXPOSO-METER nebo prostřednictvím jiných souvisejících projektů. U ostatních projektů bude před zahájením prací vyžádán písemný souhlas.

Jako druhou možnost by vyšetřovatelé měli zájem přidat k chemickému profilování popsanému výše zkoumáním aplikace bioanalytických nástrojů (biotestů) k charakterizaci účinků směsi vyvolaných komplexním souborem chemikálií přítomných v lidských vzorcích. To by mohlo být provedeno buď na UFZ, prostřednictvím spolupráce EXPOSO-METER nebo prostřednictvím jiných budoucích projektů. U ostatních projektů bude před zahájením prací vyžádán písemný souhlas.