Chemometry do określania narażenia środowiska i człowieka na podstawie mieszanin zanieczyszczeń (EXPOSO-METER)

Określenie wielkości próby

Celem projektu badawczego EXPOSO-METER nie jest duże badanie kohortowe, ale pilotażowe badanie sprawdzające słuszność koncepcji, które będzie podstawą przyszłych prac. Dlatego zastosowano dwa podejścia do określenia wielkości próby:

1. Na podstawie przeglądu literatury dotyczącej podobnych badań zidentyfikowano ściśle pasujący przykład z czasopisma wysokiego szczebla. Pracowało łącznie z 16 osobami z dwóch niemieckich miast (różne tkanki, łącznie 88 próbek). Praca w EXPOSO-METER znacznie przekroczy tę liczbę uczestników badania. Ponadto oczekuje się, że trzy regiony świata wykażą wyraźne różnice na dużą skalę ze względu na odmienny styl życia i warunki narażenia w Stanach Zjednoczonych, Europie i Korei Południowej.
2. Do obliczenia liczebności próby zastosowano wzór Cochrana [n= (Z^2 p(1-p))/e^2]: z 90-procentowym poziomem ufności (Z=1,645), maksymalna zmienność (50 procent, tj. p = 0,5) i +/-10 procent precyzji (e = 0,1), daje minimalną wielkość próby 68 uczestników.

W sumie minimalna wielkość próby wynosi zatem 50 uczestników badania na region, przy czym idealnym rozwiązaniem jest 100 uczestników badania na region.

Kolekcja próbek

Docelowy rozkład uczestników badania: 25 kobiet i 25 mężczyzn w wieku 30-40 lat oraz 5 kobiet i 5 mężczyzn w każdej z tych grup wiekowych: 20-30, 40-50, 50-60, 60-70 , 70-80 lat. Pobiera się następujące próbki: (1) 2-20 g wyciętego lipidu podskórnego z podbrzusza, umieszcza się w szklanej fiolce oznaczonej niepowtarzalnym numerem identyfikacyjnym próbki (ID) i przechowuje w temperaturze -20 °C; (2) 5 ml krwi przy użyciu probówki wypełnionej środkiem kompleksującym, kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i oznaczonej identyfikatorem, i przechowywane w temperaturze -20 °C. Ponadto uczestnicy badania proszeni są o wypełnienie kwestionariusza uczestników, który zostanie oznaczony identyfikatorem. Po skompletowaniu zestaw próbek jest wysyłany do laboratoriów UFZ.

Przetwarzanie próbek w UFZ

Tkanka lipidowa: Próbki będą rozmrażane, homogenizowane i określana jest zawartość lipidów. (a) Pobieranie próbek w stanie równowagi biernej: Do próbki dodaje się próbniki cienkowarstwowe silikonowe, które są arkuszami silikonu klasy medycznej o odpowiednim rozmiarze i grubości, wstępnie oczyszczonymi za pomocą ekstrakcji Soxhleta octanem etylu. po ok. Po 48 h (wymagane do zrównoważenia) silikon jest usuwany, jego powierzchnia dokładnie czyszczona, a chemikalia z silikonu ekstrahowane octanem etylu. (b) Całkowita ekstrakcja: Podpróbka tkanki lipidowej zostanie bezpośrednio wyekstrahowana różnymi mieszaninami rozpuszczalników. Rozpuszczalnik z obu podejść jest odparowywany, próbki są czyszczone przez szereg kolumn, a substancje chemiczne są analizowane za pomocą chromatografii gazowo-cieczowej (GC/LC) połączonej z wysokorozdzielczą spektrometrią mas (HRMS) lub tandemową spektrometrią mas (MS/ SM). W sumie 150 + 400 chemikaliów zostanie przebadanych pod kątem użycia tych dwóch technik. W celu zapewnienia jakości/kontroli jakości stosuje się stabilne wewnętrzne związki wzorcowe znakowane izotopowo. Wyniki zostaną umieszczone w kontekście regionów, a dane z kwestionariuszy zostaną wykorzystane do wsparcia interpretacji danych.

Krew: Próbki krwi zostaną poddane obecnie opracowywanej procedurze ekstrakcji, podobnej do podejść opisanych powyżej, ekstrakty są czyszczone, zagęszczane i analizowane za pomocą GC/LC-HRMS (lub MS/MS), jak opisano powyżej.

Możliwe rozszerzenia

Jako pierwszą opcję dalszego rozszerzenia tej pracy, badacze zamierzają zbadać nieukierunkowane badania przesiewowe szerokich mieszanin chemikaliów, które są oznaczane ilościowo w trybie ukierunkowanym w UFZ. Prawdopodobnie istnieje o wiele więcej chemikaliów, jeszcze niezidentyfikowanych, które byłyby interesujące do zbadania w UFZ, w ramach współpracy EXPOSO-METER lub w ramach innych powiązanych projektów. W przypadku innych projektów wymagana jest pisemna zgoda przed rozpoczęciem prac.

Jako drugą opcję badacze byliby zainteresowani dodaniem do opisanego powyżej profilowania chemicznego poprzez zbadanie zastosowania narzędzi bioanalitycznych (testów biologicznych) w celu scharakteryzowania efektów mieszaniny wywołanych przez złożoną gamę chemikaliów obecnych w próbkach ludzkich. Można to zrobić w UFZ, w ramach współpracy EXPOSO-METER lub w ramach innych przyszłych projektów. W przypadku innych projektów wymagana jest pisemna zgoda przed rozpoczęciem prac.