In vitro demonstrace přímých účinků enzymu PCSK9 souvisejících s krevními destičkami

Stěžejní role krevních destiček během arteriálních ischemických příhod, jako je infarkt myokardu (IM), cévní mozková příhoda a kardiovaskulární (KV) úmrtí, a významná role účinné protidestičkové terapie při snižování těchto příhod byly dobře definovány. Byla prokázána nezávislá souvislost mezi plazmatickými hladinami PCSK9, zvýšenou reaktivitou krevních destiček a ischemickými výsledky u pacientů s akutními koronárními syndromy (ACS). Bylo navrženo spojení plazmatických hladin PCSK9 s rizikem onemocnění koronárních tepen (CAD), nezávisle na hladinách cholesterolu s nízkou hustotou lipoproteinů (LDL-C). Na základě metaanalýzy studií pacientů se středně vysokým rizikem kardiovaskulárního onemocnění (CVD) výzkumníci prokázali významnou úmrtnost a snížení IM pomocí protilátek proti PCSK9 a navrhli relevantní antiischemickou/protidestičkovou úlohu protilátek proti PCSK9. Tato pozorování podporují hypotézu, že antiischemické účinky léčby inhibitory PCSK9 souvisí s jejími pleiotropními účinky na krevní destičky.

In vitro studie na zvířatech a lidech naznačily přímé účinky inhibitorů PCSK9 a PCSK9 na krevní destičky. PCSK9 nepřímo aktivuje krevní destičky prostřednictvím zvýšených hladin LDL-C a oxLDL. oxLDL může aktivovat krevní destičky vazbou na scavenger receptory CD36 a LOX-1. Kromě toho byl navržen přímý vztah mezi PCSK9 a aktivací krevních destiček prostřednictvím scavengerových receptorů CD36 a lektinu podobný oxidovaný LDL receptor (LOX)-1. Inkubace lidského rekombinantního proteinu PCSK9 s plazmou bohatou na krevní destičky odebranou od zdravých subjektů významně zvýšila expresi aktivovaného receptoru GPIIb/IIIa a agregaci krevních destiček vyvolanou suboptimálními koncentracemi epinefrinu. V experimentech in vitro zvýšila expozice lidského rekombinantního PCSK9 expresi LOX-1 v lidských vaskulárních endoteliálních buňkách a buňkách hladkého svalstva. Podobně myši LOX-1 KO vykazovaly nižší hladiny PCSK9 a myši PCSK9-KO vykazovaly mnohem nižší hladiny LOX-1, což ukazuje na reciproční vztah mezi PCSK9 a LOX-1. Podobný reciproční vztah mezi hladinami PCSK9 a expresí LOX-1 a CD36 nebyl prokázán u lidských krevních destiček.

In vitro imunoblotovací experimenty prokázaly přítomnost PCSK9 v krevních destičkách získaných od pacientů s CAD a experimenty s průtokovou cytometrií prokázaly, že peptid související s kolagenem (CP) významně zvýšil povrchovou expresi PCSK9 na krevních destičkách. Kromě toho protilátky PCSK9 významně inhibovaly ADP- a CP-indukovanou agregaci krevních destiček a tvorbu trombu závislou na krevních destičkách na imobilizovaném povrchu kolagenu při vysoké smykové rychlosti (1000s-1). Vazba PCSK9 na CD36 spouští aktivaci krevních destiček prostřednictvím aktivace nikotinamidadenindinukleotid fosfát oxidázy (Nox)2, uvolňování reaktivních forem kyslíku (ROS) a následné aktivace receptoru GPIIb/IIIa a uvolňování p-selektinu. Kromě toho Nox2 indukuje tvorbu 8-Iso-prostaglandinu F2α a tromboxanu (Tx) A2 prostřednictvím aktivace cytosolové fosfolipázy A2 a nakonec vede k aktivaci receptoru GP-IIb/IIIa a uvolňování p-selektinu. Byl prokázán vztah mezi plazmatickým PCSK9, 11-dehydro-TxB2 v moči a KV příhodami u pacientů s fibrilací síní. Kromě toho promyté krevní destičky resuspendované v plazmě od pacientů s familiární hypercholesterolemií po léčbě inhibitorem PCSK9 indukovaly nižší agregaci krevních destiček a uvolňování rozpustného peptidu odvozeného od Nox2 (sNox2-dp) než ty, které byly získány použitím plazmy před léčbou inhibitorem PCSK9 ve studii in vitro. Toto snížení bylo zvráceno přidáním oxLDL. Kromě toho byla agregace krevních destiček indukovaná oxLDL snížena inhibicí CD36, LOX-1 a Nox2. Ve stejné studii bylo prokázáno, že 6měsíční léčba inhibitory PCSK9 snižuje hladiny LDL-C, oxLDL, sérového TxB2, sNox2-dp a PCSK9 v séru.

Tato předběžná pozorování naznačují, že:

• CV přínosy spojené s terapií inhibitory PCSK9 mohou částečně souviset s jeho pleiotropními účinky na krevní destičky.
• In vitro, zvířecí a klinické studie naznačovaly přímé účinky PCSK9 na krevní destičky.
• PCSK9 ovlivňuje funkci krevních destiček prostřednictvím aktivity Nox2 zprostředkované receptorem CD36/LOX-1.

Potenciální přímé účinky PCSK9 na krevní destičky však nebyly prokázány v komplexní studii zahrnující různorodou populaci zdravých dobrovolníků a subjektů s kardiovaskulárními rizikovými faktory. Zahrnutí alespoň 3 KV rizikových faktorů zvýší šanci na nalezení subjektů se zvýšeným fenotypem reaktivity krevních destiček a prokázání zvýšeného účinku PCSK9 souvisejícího s krevními destičkami. Přítomnost těchto rizikových faktorů byla tradičně připisována zvýšené prevalenci KVO a souvisejícímu riziku.

V současných KV klinických studiích je zastoupeno velmi nízké procento (<10 %) Afroameričanů navzdory výraznějšímu riziku KVO. Dále bylo prokázáno, že hladiny PCSK9 jsou významně vyšší u Afroameričanů oproti bělochům (104 ± 29 vs. 95 ± 30 ng/ml, v tomto pořadí; P = 0,020). V nemocnici Sinai v Baltimoru vyšetřovatelé zaznamenali vyšší míru ischemických příhod po PCI a vyšší úmrtnost u Afroameričanů než u bělochů. Vzácné mutace se ztrátou funkce (LoF) PCSK9 byly spojeny s nízkými hladinami LDL-C (o 28 % nižší u černochů a o 15 % u bílých) a s ještě působivějším snížením rizika onemocnění koronárních tepen (CAD ) (88 % a 47 %). PCSK9 LoF varianty byly spojeny s 35 mg/dl a 13 mg/dl nižšími hladinami LDL-C u Afroameričanů a bělochů a o 49 % a 18 % nižším rizikem koronárního srdečního onemocnění u Afroameričanů a bělochů, v daném pořadí. Ve studii 10 196 dospělých Afroameričanů v USA byly varianty PCSK9 LoF spojeny s nižšími koncentracemi lipoproteinu (Lpa) a OxPL-apoB. Tyto údaje naznačují přímý vztah mezi PCSK9 a rizikem ICHS a důležitost snížení hladin PCSK9 při snižování rizika ICHS u Afroameričanů.

Poznatky získané naší explorativní mechanistickou studií nám pomohou pochopit přímé účinky inhibitoru PCSK9 a PCSK9 na krevní destičky a usnadní klinickou aplikaci inhibitorů PCSK9 u širokého spektra pacientů s kardiovaskulárním rizikem.