Demonstração in vitro dos efeitos diretos da enzima PCSK9 relacionados às plaquetas

O papel central das plaquetas durante eventos isquêmicos arteriais, como infarto do miocárdio (IM), acidente vascular cerebral e morte cardiovascular (CV), e o papel significativo da terapia antiplaquetária potente na redução desses eventos foram bem definidos. Foi demonstrada uma associação independente entre níveis plasmáticos de PCSK9, reatividade plaquetária elevada e desfechos isquêmicos em pacientes com síndromes coronarianas agudas (SCA). A associação dos níveis plasmáticos de PCSK9 com o risco de doença arterial coronariana (DAC), independente dos níveis de colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C), tem sido sugerida. Com base em uma meta-análise de ensaios de pacientes com doença cardiovascular (DCV) de risco médio-alto, os investigadores demonstraram uma redução significativa da mortalidade e do IM com anticorpos PCSK9 e sugeriram um papel anti-isquêmico/antiplaquetário relevante dos anticorpos PCSK9. Estas observações apoiam a hipótese de que os efeitos anti-isquémicos da terapia com inibidores de PCSK9 estão relacionados com os seus efeitos pleiotrópicos nas plaquetas.

Estudos in vitro, em animais e em humanos sugeriram os efeitos diretos dos inibidores de PCSK9 e PCSK9 nas plaquetas. PCSK9 ativa indiretamente as plaquetas através de níveis elevados de LDL-C e LDL-ox. oxLDL pode ativar plaquetas ligando-se aos receptores necrófagos CD36 e LOX-1. Além disso, foi sugerida uma relação direta entre PCSK9 e ativação plaquetária através dos receptores necrófagos CD36 e do receptor de LDL oxidado semelhante à lectina (LOX) -1. A incubação da proteína PCSK9 recombinante humana com plasma rico em plaquetas coletado de indivíduos saudáveis ​​melhorou significativamente a expressão do receptor GPIIb/IIIa ativado e a agregação plaquetária induzida por concentrações subótimas de epinefrina. Em experimentos in vitro, a exposição à PCSK9 recombinante humana aumentou a expressão de LOX-1 em células endoteliais vasculares humanas e células musculares lisas. Da mesma forma, os camundongos LOX-1 KO apresentaram níveis mais baixos de PCSK9 e os camundongos PCSK9-KO apresentaram níveis de LOX-1 muito mais baixos, indicando uma relação recíproca entre PCSK9 e LOX-1. Uma relação recíproca semelhante entre os níveis de PCSK9 e a expressão de LOX-1 e CD36 não foi demonstrada em plaquetas humanas.

Experimentos de imunotransferência in vitro demonstraram a presença de PCSK9 em plaquetas obtidas de pacientes com DAC, e experimentos de citometria de fluxo demonstraram que o peptídeo relacionado ao colágeno (CP) aumentou significativamente a expressão superficial de PCSK9 em plaquetas. Além disso, os anticorpos PCSK9 inibiram significativamente a agregação plaquetária induzida por ADP e CP e a formação de trombos dependentes de plaquetas na superfície do colágeno imobilizado sob alta taxa de cisalhamento (1000s-1). A ligação de PCSK9 a CD36 desencadeia a ativação plaquetária através da ativação da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase (Nox)2, liberação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e subsequente ativação do receptor GPIIb/IIIa e liberação de p-selectina. Além disso, o Nox2 induz a geração de 8-Iso-prostaglandina F2α e tromboxano (Tx) A2 através da ativação da fosfolipase A2 citosólica e finalmente resulta na ativação do receptor GP-IIb/IIIa e na liberação de p-selectina. A relação entre PCSK9 plasmática, 11-dehidro-TxB2 urinário e eventos CV em pacientes com fibrilação atrial foi demonstrada. Além disso, as plaquetas lavadas ressuspensas no plasma de pacientes com hipercolesterolemia familiar após o tratamento com inibidor de PCSK9 induziram menor agregação plaquetária e liberação de peptídeo derivado de Nox2 solúvel (sNox2-dp) do que aquelas obtidas usando plasma antes do tratamento com inibidor de PCSK9 em um estudo in vitro. Essa redução foi revertida pela adição de LDL-ox. Além disso, a agregação plaquetária induzida pelo LDL-ox foi reduzida pela inibição de CD36, LOX-1 e Nox2. No mesmo estudo, o tratamento de 6 meses com inibidores de PCSK9 demonstrou reduzir os níveis séricos de LDL-C, LDL-ox, TxB2 sérico, sNox2-dp e PCSK9.

Estas observações preliminares sugerem que:

• Os benefícios CV associados à terapia com inibidores da PCSK9 podem estar, em parte, relacionados aos seus efeitos pleiotrópicos nas plaquetas.
• Estudos in vitro, em animais e clínicos sugeriram efeitos diretos da PCSK9 nas plaquetas.
• PCSK9 influencia a função plaquetária através da atividade Nox2 mediada pelo receptor CD36/LOX-1.

No entanto, os potenciais efeitos plaquetários diretos da PCSK9 nas plaquetas não foram demonstrados num estudo abrangente envolvendo uma população diversificada de voluntários saudáveis ​​e indivíduos com fatores de risco cardiovascular. A inclusão de pelo menos 3 fatores de risco CV aumentará a chance de encontrar indivíduos com um fenótipo de reatividade plaquetária elevada e demonstração de efeito aumentado da PCSK9 relacionado às plaquetas. A presença destes factores de risco tem sido tradicionalmente atribuída ao aumento da prevalência de DCV e do risco associado.

Nos ensaios clínicos CV contemporâneos, uma percentagem muito baixa (<10%) de afro-americanos está representada, apesar de um risco mais pronunciado de DCV. Além disso, foi demonstrado que os níveis de PCSK9 são significativamente mais elevados em afro-americanos versus caucasianos (104 ± 29 vs 95 ± 30 ng/mL, respectivamente; P = 0,020). No Hospital Sinai de Baltimore, os investigadores relataram taxas mais elevadas de eventos isquêmicos pós-ICP e maior mortalidade em afro-americanos do que em brancos. Mutações raras de perda de função (LoF) de PCSK9 têm sido associadas a baixos níveis de LDL-C (28% mais baixos em negros e 15% em brancos) e a uma redução ainda mais impressionante no risco de doença arterial coronariana (DAC). ) (88% e 47%, respectivamente). As variantes PCSK9 LoF foram associadas a níveis 35 mg/dL e 13 mg/dL mais baixos de LDL-C em afro-americanos e caucasianos, respectivamente, e um risco 49% e 18% menor de doença coronariana em afro-americanos e caucasianos, respectivamente. Em um estudo com 10.196 adultos afro-americanos dos EUA, as variantes PCSK9 LoF foram associadas a concentrações mais baixas de lipoproteína (Lpa) e OxPL-apoB. Estes dados indicam uma relação direta entre PCSK9 e o risco de DAC, e a importância de reduzir os níveis de PCSK9 na redução do risco de DAC entre os afro-americanos.

O conhecimento adquirido pelo nosso estudo mecanístico exploratório nos ajudará a compreender os efeitos diretos da PCSK9 e do inibidor de PCSK9 nas plaquetas e facilitará a aplicação clínica dos inibidores de PCSK9 em uma ampla gama de pacientes com risco cardiovascular.