Wykazanie in vitro bezpośredniego działania enzymu PCSK9 na płytki krwi

Dobrze zdefiniowano kluczową rolę płytek krwi podczas zdarzeń niedokrwiennych tętnic, takich jak zawał mięśnia sercowego (MI), udar mózgu i śmierć z przyczyn sercowo-naczyniowych (CV), a także znaczącą rolę silnej terapii przeciwpłytkowej w ograniczaniu tych zdarzeń. Wykazano niezależny związek między poziomem PCSK9 w osoczu, podwyższoną reaktywnością płytek krwi i wynikami niedokrwienia u pacjentów z ostrymi zespołami wieńcowymi (ACS). Sugeruje się związek poziomu PCSK9 w osoczu z ryzykiem choroby wieńcowej (CAD), niezależnie od poziomu cholesterolu lipoprotein o małej gęstości (LDL-C). Na podstawie metaanalizy badań pacjentów z chorobami układu krążenia o średnim i wysokim ryzyku (CVD), badacze wykazali znaczną redukcję śmiertelności i zawału serca przy stosowaniu przeciwciał PCSK9 i zasugerowali istotną rolę przeciwciał PCSK9 w niedokrwieniu i działaniu przeciwpłytkowym. Obserwacje te potwierdzają hipotezę, że przeciwniedokrwienne działanie terapii inhibitorem PCSK9 jest związane z jej plejotropowym działaniem na płytki krwi.

Badania in vitro na zwierzętach i ludziach sugerują bezpośredni wpływ PCSK9 i inhibitorów PCSK9 na płytki krwi. PCSK9 pośrednio aktywuje płytki krwi poprzez podwyższony poziom LDL-C i oxLDL. oxLDL może aktywować płytki krwi poprzez wiązanie się z receptorami zmiatającymi CD36 i LOX-1. Ponadto zasugerowano bezpośredni związek między PCSK9 a aktywacją płytek krwi przez receptory zmiatające CD36 i receptor utlenionego LDL podobny do lektyny (LOX)-1. Inkubacja ludzkiego rekombinowanego białka PCSK9 z osoczem bogatopłytkowym pobranym od zdrowych osób znacząco zwiększyła ekspresję aktywowanego receptora GPIIb/IIIa i agregację płytek krwi indukowaną suboptymalnym stężeniem epinefryny. W doświadczeniach in vitro ekspozycja na ludzki rekombinowany PCSK9 zwiększyła ekspresję LOX-1 w ludzkich komórkach śródbłonka naczyń i komórkach mięśni gładkich. Podobnie myszy LOX-1 KO wykazywały niższe poziomy PCSK9, a myszy PCSK9-KO wykazywały znacznie niższe poziomy LOX-1, co wskazuje na wzajemną zależność między PCSK9 i LOX-1. Podobnej wzajemnej zależności między poziomami PCSK9 a ekspresją LOX-1 i CD36 nie wykazano w ludzkich płytkach krwi.

Eksperymenty immunoblottingu in vitro wykazały obecność PCSK9 w płytkach krwi uzyskanych od pacjentów z CAD, a eksperymenty z cytometrią przepływową wykazały, że peptyd związany z kolagenem (CP) znacząco zwiększał powierzchniową ekspresję PCSK9 na płytkach krwi. Ponadto przeciwciała PCSK9 znacząco hamowały indukowaną przez ADP i CP agregację płytek krwi i zależne od płytek tworzenie się skrzeplin na powierzchni unieruchomionego kolagenu przy dużej szybkości ścinania (1000 s-1). Wiązanie PCSK9 z CD36 powoduje aktywację płytek krwi poprzez aktywację oksydazy fosforanowej dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (Nox)2, uwolnienie reaktywnych form tlenu (ROS), a następnie aktywację receptora GPIIb/IIIa i uwolnienie p-selektyny. Ponadto Nox2 indukuje wytwarzanie 8-izo-prostaglandyny F2α i tromboksanu (Tx) A2 poprzez aktywację cytozolowej fosfolipazy A2 i ostatecznie powoduje aktywację receptora GP-IIb/IIIa i uwolnienie p-selektyny. Wykazano związek pomiędzy PCSK9 w osoczu, 11-dehydro-TxB2 w moczu i zdarzeniami sercowo-naczyniowymi u pacjentów z migotaniem przedsionków. Ponadto przemyte płytki ponownie zawieszone w osoczu pacjentów z rodzinną hipercholesterolemią po leczeniu inhibitorem PCSK9 indukowały niższą agregację płytek krwi i uwalnianie rozpuszczalnego peptydu pochodzącego od Nox2 (sNox2-dp) niż te uzyskane przy użyciu osocza przed leczeniem inhibitorem PCSK9 w badaniu in vitro. Zmniejszenie to zostało odwrócone przez dodanie oxLDL. Ponadto agregacja płytek indukowana oxLDL została zmniejszona poprzez hamowanie CD36, LOX-1 i Nox2. W tym samym badaniu wykazano, że 6-miesięczne leczenie inhibitorami PCSK9 zmniejsza poziomy LDL-C, oxLDL, TxB2, sNox2-dp i PCSK9 w surowicy.

Te wstępne obserwacje sugerują, że:

• Korzyści sercowo-naczyniowe związane z terapią inhibitorem PCSK9 mogą być częściowo związane z jego plejotropowym działaniem na płytki krwi.
• Badania in vitro, na zwierzętach i kliniczne sugerują bezpośredni wpływ PCSK9 na płytki krwi.
• PCSK9 wpływa na funkcję płytek krwi poprzez aktywność Nox2 za pośrednictwem receptora CD36/LOX-1.

Jednakże potencjalnego bezpośredniego wpływu PCSK9 na płytki krwi nie wykazano w kompleksowym badaniu z udziałem zróżnicowanej populacji zdrowych ochotników i osób z czynnikami ryzyka chorób sercowo-naczyniowych. Włączenie co najmniej 3 czynników ryzyka CV zwiększy szansę na znalezienie osób z fenotypem podwyższonej reaktywności płytek krwi i wykazanie nasilonego działania PCSK9 na płytki krwi. Obecność tych czynników ryzyka tradycyjnie przypisywano zwiększonej częstości występowania chorób sercowo-naczyniowych i związanego z nimi ryzyka.

We współczesnych badaniach klinicznych dotyczących chorób CV reprezentowany jest bardzo niski odsetek (<10%) Afroamerykanów, pomimo bardziej wyraźnego ryzyka CVD. Ponadto wykazano, że poziomy PCSK9 są znacząco wyższe u Afroamerykanów w porównaniu z osobami rasy kaukaskiej (odpowiednio 104 ± 29 vs 95 ± 30 ng/ml; P = 0,020). W szpitalu Sinai w Baltimore badacze zgłosili większą częstość incydentów niedokrwiennych po PCI i większą śmiertelność u Afroamerykanów niż u rasy białej. Rzadkie mutacje powodujące utratę funkcji (LoF) w PCSK9 powiązano z niskim poziomem LDL-C (28% niższy u osób rasy czarnej i 15% u rasy białej) oraz z jeszcze bardziej imponującym zmniejszeniem ryzyka choroby wieńcowej (CAD ) (odpowiednio 88% i 47%). Warianty PCSK9 LoF powiązano z niższym o 35 mg/dl i 13 mg/dl poziomem LDL-C odpowiednio u Afroamerykanów i osób rasy kaukaskiej oraz o 49% i 18% niższym ryzykiem choroby niedokrwiennej serca odpowiednio u Afroamerykanów i osób rasy kaukaskiej. W badaniu z udziałem 10 196 dorosłych Afroamerykanów w USA warianty PCSK9 LoF powiązano z niższymi stężeniami lipoprotein (Lpa) i OxPL-apoB. Dane te wskazują na bezpośredni związek między PCSK9 a ryzykiem choroby wieńcowej oraz znaczenie obniżania poziomu PCSK9 w zmniejszaniu ryzyka choroby wieńcowej wśród Afroamerykanów.

Wiedza zdobyta w wyniku naszego eksploracyjnego badania mechanistycznego pomoże nam zrozumieć bezpośredni wpływ PCSK9 i inhibitora PCSK9 na płytki krwi i ułatwi kliniczne zastosowanie inhibitorów PCSK9 u szerokiego grona pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym.