Demostración in vitro de los efectos directos de la enzima PCSK9 relacionados con las plaquetas

Se ha definido bien el papel fundamental de las plaquetas durante los eventos isquémicos arteriales, como el infarto de miocardio (IM), el accidente cerebrovascular y la muerte cardiovascular (CV), y el papel importante de la terapia antiplaquetaria potente en la reducción de estos eventos. Se ha demostrado una asociación independiente entre los niveles plasmáticos de PCSK9, la reactividad plaquetaria elevada y los resultados isquémicos en pacientes con síndromes coronarios agudos (SCA). Se ha sugerido la asociación de los niveles plasmáticos de PCSK9 con el riesgo de enfermedad de las arterias coronarias (EAC), independientemente de los niveles de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-C). Basado en un metanálisis de ensayos de pacientes con enfermedad cardiovascular (ECV) de riesgo medio-alto, los investigadores han demostrado una mortalidad significativa y una reducción del IM con anticuerpos PCSK9 y han sugerido un papel antiisquémico/antiplaquetario relevante de los anticuerpos PCSK9. Estas observaciones respaldan la hipótesis de que los efectos antiisquémicos de la terapia con inhibidores de PCSK9 están relacionados con sus efectos pleiotrópicos sobre las plaquetas.

Los estudios in vitro, en animales y en humanos han sugerido los efectos directos de la PCSK9 y los inhibidores de la PCSK9 sobre las plaquetas. PCSK9 activa indirectamente las plaquetas a través de niveles elevados de LDL-C y oxLDL. oxLDL puede activar las plaquetas uniéndose a los receptores carroñeros CD36 y LOX-1. Además, se ha sugerido una relación directa entre PCSK9 y la activación plaquetaria a través de los receptores eliminadores CD36 y el receptor de LDL oxidado similar a la lectina (LOX) -1. La incubación de la proteína PCSK9 recombinante humana con plasma rico en plaquetas extraído de sujetos sanos mejoró significativamente la expresión del receptor GPIIb/IIIa activado y la agregación plaquetaria inducida por concentraciones subóptimas de epinefrina. En experimentos in vitro, la exposición a PCSK9 recombinante humana mejoró la expresión de LOX-1 en células endoteliales vasculares humanas y células de músculo liso. De manera similar, los ratones LOX-1 KO mostraron niveles más bajos de PCSK9 y los ratones PCSK9-KO mostraron niveles mucho más bajos de LOX-1, lo que indica una relación recíproca entre PCSK9 y LOX-1. No se ha demostrado en plaquetas humanas una relación recíproca similar entre los niveles de PCSK9 y la expresión de LOX-1 y CD36.

Los experimentos de inmunotransferencia in vitro demostraron la presencia de PCSK9 en plaquetas obtenidas de pacientes con CAD, y los experimentos de citometría de flujo demostraron que el péptido relacionado con el colágeno (CP) mejoraba significativamente la expresión superficial de PCSK9 en las plaquetas. Además, los anticuerpos PCSK9 inhibieron significativamente la agregación plaquetaria inducida por ADP y CP y la formación de trombos dependientes de plaquetas en la superficie de colágeno inmovilizado bajo una alta velocidad de cizallamiento (1000s-1). La unión de PCSK9 a CD36 desencadena la activación plaquetaria mediante la activación de la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidasa (Nox) 2, la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la posterior activación del receptor GPIIb/IIIa y la liberación de p-selectina. Además, Nox2 induce la generación de 8-iso-prostaglandina F2α y tromboxano (Tx) A2 mediante la activación de la fosfolipasa A2 citosólica y finalmente da como resultado la activación del receptor GP-IIb/IIIa y la liberación de p-selectina. Se ha demostrado la relación entre la PCSK9 plasmática, el 11-dehidro-TxB2 urinario y los eventos CV en pacientes con fibrilación auricular. Además, las plaquetas lavadas resuspendidas en plasma de pacientes con hipercolesterolemia familiar después del tratamiento con inhibidor de PCSK9 indujeron una menor agregación plaquetaria y liberación de péptido derivado de Nox2 soluble (sNox2-dp) que las obtenidas usando plasma antes del tratamiento con inhibidor de PCSK9 en un estudio in vitro. Esta reducción se revirtió mediante la adición de oxLDL. Además, la agregación plaquetaria inducida por oxLDL se redujo mediante la inhibición de CD36, LOX-1 y Nox2. En el mismo estudio, se demostró que el tratamiento de 6 meses con inhibidores de PCSK9 reduce los niveles séricos de LDL-C, oxLDL, TxB2, sNox2-dp y PCSK9 en suero.

Estas observaciones preliminares sugieren que:

• Los beneficios CV asociados con la terapia con inhibidores de PCSK9 pueden estar relacionados en parte con sus efectos pleiotrópicos sobre las plaquetas.
• Los estudios in vitro, en animales y clínicos sugirieron efectos directos de PCSK9 sobre las plaquetas.
• PCSK9 influye en la función plaquetaria a través de la actividad Nox2 mediada por el receptor CD36/LOX-1.

Sin embargo, los posibles efectos plaquetarios directos de la PCSK9 sobre las plaquetas no se han demostrado en un estudio exhaustivo en el que participe una población diversa de voluntarios sanos y sujetos con factores de riesgo cardiovascular. La inclusión de al menos 3 factores de riesgo CV aumentará la posibilidad de encontrar sujetos con un fenotipo de reactividad plaquetaria elevada y demostración de un efecto mejorado de PCSK9 relacionado con las plaquetas. La presencia de estos factores de riesgo se ha atribuido tradicionalmente a una mayor prevalencia de ECV y al riesgo asociado.

En los ensayos clínicos de CV contemporáneos, un porcentaje muy bajo (<10%) de afroamericanos está representado a pesar de un riesgo de ECV más pronunciado. Además, se ha demostrado que los niveles de PCSK9 son significativamente mayores en afroamericanos que en caucásicos (104 ± 29 frente a 95 ± 30 ng/ml, respectivamente; P = 0,020). En el Hospital Sinai de Baltimore, los investigadores han informado tasas más altas de eventos isquémicos posteriores a la PCI y una mayor mortalidad en los afroamericanos que en los blancos. Las raras mutaciones de pérdida de función (LoF) de PCSK9 se han asociado con niveles bajos de LDL-C (28% más bajos en negros y 15% en blancos) y con una reducción aún más impresionante en el riesgo de enfermedad de las arterias coronarias (CAD). ) (88% y 47%, respectivamente). Las variantes de PCSK9 LoF se asociaron con niveles de LDL-C 35 mg/dL y 13 mg/dL más bajos en afroamericanos y caucásicos, respectivamente, y un 49% y 18% menos de riesgo de enfermedad coronaria en afroamericanos y caucásicos, respectivamente. En un estudio de 10.196 adultos afroamericanos estadounidenses, las variantes de LoF de PCSK9 se asociaron con concentraciones más bajas de lipoproteína (Lpa) y OxPL-apoB. Estos datos indican una relación directa entre PCSK9 y el riesgo de CAD, y la importancia de reducir los niveles de PCSK9 para reducir el riesgo de CAD entre los afroamericanos.

El conocimiento adquirido por nuestro estudio mecanicista exploratorio nos ayudará a comprender los efectos directos de PCSK9 y el inhibidor de PCSK9 sobre las plaquetas y facilitar la aplicación clínica de los inhibidores de PCSK9 en una amplia gama de pacientes con riesgo cardiovascular.